DLLME—TLC快速檢測(cè)血、尿中有機(jī)磷農(nóng)藥

滕軍

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004)

有機(jī)磷殺蟲(chóng)藥(organophosphorus pesticides，OP)是一種殺蟲(chóng)效力強(qiáng)、對(duì)植物藥害較小的人工合成有機(jī)磷酸酯類化合物，在我國(guó)農(nóng)村被廣泛運(yùn)用。但因大量和不科學(xué)使用，其中毒事件時(shí)有發(fā)生。目前，常見(jiàn)的有機(jī)磷農(nóng)藥快速測(cè)定方法有：光譜法、免疫分析法、酶抑制法和生物傳感器技術(shù)[1～3]等。血、尿中有機(jī)磷農(nóng)藥提取常用方法有：液-液萃取和固相萃取[4～6]兩種方法。近年來(lái)發(fā)展了頂空固相微萃取[7]技術(shù)。這些方法都存在操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)或需要使用大量對(duì)人體有毒有害、引起環(huán)境污染的有機(jī)溶劑。Rezaee等于2006年首次報(bào)道了分散液-液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME) 技 術(shù) 。DLLME用于血、尿中有機(jī)磷農(nóng)藥的提取在國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DLLME與薄層色譜法[8](thin layer chromatography,TLC)技術(shù)相結(jié)合，建立了血、尿中敵敵畏、樂(lè)果、馬拉硫磷和乙基對(duì)硫磷4種有機(jī)磷農(nóng)藥的快速定性方法。本方法不需要特殊裝置和昂貴大型儀器設(shè)備，便于在基層推廣，適于對(duì)樣品進(jìn)行快速初步篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 XW-80A型漩渦混合器(江蘇海門(mén)麒麟醫(yī)用儀器廠)，AR1530/C型電子天平 (美國(guó)OHAUS CORP)，硅膠板(青島海洋化工廠分廠)；樂(lè)果標(biāo)樣由國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)檢中心提供，含量≥99.0%；敵敵畏、馬拉硫磷、乙基對(duì)硫磷均由天津農(nóng)藥股份有限公司提供，上述4種農(nóng)藥均用丙酮配制成濃度為10mg/ml或20mg/ml的儲(chǔ)備液，在冰箱中保存，臨用時(shí)用丙酮稀釋成濃度為1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。

顯色劑：溴酚藍(lán)-醋酸試劑、間苯二酚-氫氧化鈉試劑

展開(kāi)劑：三氯甲烷-丙酮(4:1)、苯-石油醚-丙酮(7:2:1)

丙酮、三氯甲烷、苯、石油醚、無(wú)水乙醇、溴酚藍(lán)、醋酸、間苯二酚、氫氧化鈉、硝酸銀等均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ超純水。

1.2 方法

1.2 .1尿液中農(nóng)藥提取 取兩份5m l尿液于2支10m l具塞比色管中，分別加入1ml分散劑丙酮，混勻，再加入80μl萃取劑三氯甲烷，小心振搖2min，靜置1min，吸棄上層尿液，用玻璃毛細(xì)管吸取管底部的萃取劑三氯甲烷進(jìn)行定性分析。

1.2 .2血液中農(nóng)藥提取 稱取兩份全血(血塊搗碎)各5g放于50ml燒杯中，分別加入5ml純水，1ml丙酮，在漩渦混合器上混合30s，將上層液體轉(zhuǎn)入2支10m l具塞比色管中，各加入80μl三氯甲烷，小心振搖2min，靜置1min，吸棄上層液體，剩余的萃取劑轉(zhuǎn)入2個(gè)10ml小燒杯中，于小燒杯中加入0.2～0.4g無(wú)水硫酸鈉，拌勻，再加入80μl三氯甲烷反提，稍候，待反提劑濃縮至10～20μl即可用于定性分析。

1.2 .3定性 按GA/T101-1995[8]中薄層色譜法進(jìn)行定性分析。將兩份平行樣品農(nóng)藥提取劑分別點(diǎn)樣于兩塊硅膠板上，并在兩塊板上點(diǎn)上相應(yīng)的幾種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液，然后分別在兩種展開(kāi)劑中展開(kāi)，取出，揮干展開(kāi)劑，進(jìn)行顯色。含硫有機(jī)磷農(nóng)藥用溴酚藍(lán)-醋酸試劑顯色，敵敵畏用間苯二酚-氫氧化鈉試劑顯色。最后將樣品斑點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)斑點(diǎn)進(jìn)行比較，根據(jù)斑點(diǎn)Rf值大小定性，斑點(diǎn)顏色深淺和大小半定量。

2 結(jié)果

2.1 檢出限 本實(shí)驗(yàn)用健康人尿添加農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得4種有機(jī)磷農(nóng)藥尿液中檢出限為 2μg/ml；用血(未添加任何試劑)添加農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得4種有機(jī)磷農(nóng)藥血中檢出限為6μg/ml。

2.2 萃取劑及其體積的選擇 為了便于提取，實(shí)驗(yàn)要求萃取劑比重要大于樣品溶液的比重，且對(duì)農(nóng)藥的溶解力強(qiáng)，基于這兩點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)可選用的萃取劑有二氯甲烷與三氯甲烷，因三氯甲烷的比重較大(1.471～1.485g/ml)，所以本實(shí)驗(yàn)選用三氯甲烷作為萃取劑。 萃取劑體積分別考察了 50μl、60μl、80μl、100μl對(duì)樣液萃取效果的影響，實(shí)驗(yàn)表明萃取劑為80μl萃取效果較好，如果體積大于80μl，會(huì)稀釋所要提取的農(nóng)藥，所以本實(shí)驗(yàn)選用80μl。

2.3 分散劑及其體積的選擇 分散劑的作用是使溶液中有機(jī)物很好地分散，便于農(nóng)藥提取，同時(shí)利于萃取劑沉淀于容器底部。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙醇、丙酮的萃取效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丙酮的萃取效果最好，所以選擇丙酮作為分散劑。實(shí)驗(yàn)中分別用體積為 0.5ml、1.0ml、1.5ml的丙酮考察萃取效果，丙酮體積為1.0ml時(shí)即能很好的提取樣液中農(nóng)藥，所以選用丙酮體積為1.0ml。

2.4 萃取時(shí)間的選擇 樣液中加入分散劑和萃取劑后，振搖時(shí)間分別考察了 1min、2min、3min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萃取效率隨時(shí)間增加而提高，2min后萃取效率改變不明顯，故本實(shí)驗(yàn)選擇萃取時(shí)間為2min。

2.5 鹽的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉對(duì)萃取效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入鹽后，萃取劑不易提取。故本實(shí)驗(yàn)萃取時(shí)不加鹽。

3 討論

有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)成人口服致死量 敵敵畏10～14g(25%乳劑)、樂(lè)果2g、馬拉硫磷60g、乙基對(duì)硫磷0.1～0.3g；有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)入機(jī)體后，能迅速被吸收代謝，排出速度較快，一般在24h內(nèi)經(jīng)尿排出，少量從肺呼出和糞便排出。口服后6～12h血液中濃度達(dá)高峰，由于血液中的膽堿酯酶能迅速水解有機(jī)磷農(nóng)藥，如果農(nóng)藥進(jìn)入機(jī)體時(shí)間較長(zhǎng)，血液中則不易檢出原藥，因此，采樣應(yīng)在血液中農(nóng)藥濃度達(dá)到高峰時(shí)段進(jìn)行。在血液的存放過(guò)程中，有機(jī)磷農(nóng)藥降解速度較快，所以血樣的存放時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，采血后應(yīng)立即檢測(cè)，如果需要保存，應(yīng)低溫冷凍保存，并避免與堿性物質(zhì)接觸。在血樣和尿樣中如果未檢出原藥，應(yīng)進(jìn)一步檢測(cè)樣品中農(nóng)藥代謝物，以確定是否有機(jī)磷農(nóng)藥中毒。臨床毒物分析判斷病人是否有機(jī)磷農(nóng)藥中毒的方法多采用測(cè)定血液中膽堿酯酶活性，這種方法不能判斷病人是哪一種農(nóng)藥中毒，從而影響治療方案的確定。傳統(tǒng)的分析方法耗時(shí)太長(zhǎng)，不利于急性中毒病人的救治，因此，建立血、尿中有機(jī)磷農(nóng)藥原藥或代謝物的快速檢測(cè)方法具有重要意義。

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