薄膜分散法制備紫杉醇微乳及其質(zhì)量評價

周麗娟，劉清飛，陳曦，王義明，羅國安（1.鄭州市中心醫(yī)院藥劑科，鄭州市450007；.清華大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)研究院，北京市 100084）

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是一種萜類化合物，最早由Ghamande S等[1]從短葉紫杉的樹皮中分離并確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，是近年來療效顯著的抗癌藥物之一。它能促進微管蛋白聚合、微管裝配，防止解聚，使微管穩(wěn)定，并能抑制細胞分裂增殖，臨床可用于治療卵巢癌、乳腺癌、子宮癌、肺癌、食管癌、前列腺癌等[2]。由于紫杉醇水溶性極差（約0.001 g·L-1），口服幾乎不吸收，目前臨床應(yīng)用的注射劑是以聚氧乙烯氫化蓖麻油-無水乙醇（50∶50，V/V）制成的無色黏稠液體，臨床使用時經(jīng)氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液稀釋后靜脈滴注。但制劑中聚氧乙烯氫化蓖麻油極易引起過敏反應(yīng)和低血壓，還可導(dǎo)致PVC包裝中增塑劑的溶出，使毒性增加，稀釋后宜析晶，從而限制了臨床的應(yīng)用[3，4]。

微乳可增加難溶性藥物的溶解度，是難溶性藥物的理想載體。研究中筆者改變了傳統(tǒng)制備微乳的方法，采用制備膠束溶液或脂質(zhì)體的薄膜分散法制備了紫杉醇O/W微乳（PTX ME），并對其處方、工藝及有關(guān)理化性質(zhì)進行了研究。

1 材料

1.1 儀器

Agllent 1100型高效液相色譜儀，包括DAD檢測器（美國安捷倫公司）；TEM-philips Tecnai 20型透射電鏡（荷蘭飛利浦公司）；Zetasizer Nano ZS90型激光粒度散射儀（英國馬爾文公司）；BALZERS BAF-400D型冷凍蝕刻儀（列支敦士登公國Balzers公司）；XS105型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；VDRTEX-5型旋渦混合器（江蘇海門其林貝爾儀器公司）；RE-5285A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SPX-250型微電腦恒溫恒濕箱（上海特迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SHH-100GD型強光照射試驗箱（重慶永生試驗儀器廠）。

1.2 試藥

PTX原料（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號:20070601，純度:98.63%）；PTX ME（筆者自制，批號:071201、071202、071203，規(guī)格:10 mL∶30 mg）；炔諾酮對照品（NTD ，批號:100053-200204）、PTX對照品（批號:100382-200301）均由中國藥品生物制品檢定所提供；聚氧乙烯醚（ELP）、泊洛沙姆188（德國Basf公司）；卵磷脂（S-100）、中碳鏈甘油酯（MCT）、橄欖油（德國Lipoid公司）；注射用大豆油（江西金海棠藥用油公司）；維生素E（VE，廣州白云山制藥總廠）；脫氧膽酸鈉（美國Sigma公司）；無水檸檬酸（AR級，維坊英軒實業(yè)有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；其余試劑均為分析純，水為注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方制備

2.1.1 溶劑的選擇[5]分別取盛有約1 g的各種油（Oil）、表面活性劑（SA）、助表面活性劑（CoSA）的試管，分別逐漸加入PTX，渦旋12 h，置于60℃水浴中超聲振蕩8 h，室溫平衡24 h，若PTX溶解，則在溶劑中再逐漸加入PTX，直至達到飽和，比較PTX在各種溶劑中的相對溶解度，選擇制備PTX ME適宜的溶劑。可知，PTX 在 MCT（Oil）、ELP（SA）、無水乙醇（CoSA）中溶解度最大。PTX在不同溶劑中的相對溶解度見表1。

表1 PTX在不同溶劑中的相對溶解度（37℃）Tab 1 Relative solubility of paclitaxel in different solvents（37℃）

2.1.2 PTX ME的處方優(yōu)選 按表1的定性測定結(jié)果，選擇MCT作為油相，ELP作為SA；處方中為了減少ELP的用量，同時加入S-100作為SA，無水乙醇為CoSA；為了防止處方中的S-100氧化，加入VE作為抗氧劑；加入DOC-Na有助于提高PTX的溶解度，也可作為輔助SA。各處方中將VE的量固定為0.5%，S-100的量固定為5%（處方規(guī)格:10 mL∶30 mg）。參考文獻[5，6]中繪制的偽三元相圖，選取在微乳區(qū)域的幾個處方，制備PTX ME，以制劑的外觀性狀、稀釋后放置的穩(wěn)定性、粒徑作為評價指標(biāo)，選出最優(yōu)處方。PTX ME處方優(yōu)化見表2（配伍后穩(wěn)定性指加5%葡萄糖溶液稀釋10倍后溶液的穩(wěn)定性）。

表2 PTX ME處方優(yōu)化Tab 2 Prescription optimization of PTX ME

2.1.3 PTX ME的制備 稱取處方量的PTX、ELP、S-100、DOC-Na、MCT、VE，置于圓底燒瓶中，再加入處方量的無水乙醇，70℃水浴加熱使全部溶解，40℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸干，再于40℃真空干燥箱中干燥24 h，加入處方總量3%的無水乙醇和少量注射用水，磁力攪拌使其全溶，在磁力攪拌下緩緩滴加注射用水至全量的80%時，用適量的無水檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH值至5.0，加入注射用活性炭，吸附30 min，過濾脫炭，補加注射用水至全量，無菌條件下灌封于安瓿中，即得。結(jié)果表明，處方2、3配伍后穩(wěn)定時間長，均能滿足臨床用藥要求，但處方3中ELP的用量相對較大，過敏反應(yīng)強，故選擇2號為最優(yōu)處方。

2.2 PTX ME的質(zhì)量控制

2.2.1 外觀性狀 制備的PTX ME為澄明淡黃色液體。

2.2.2 pH值 按2005年版《中國藥典》（二部）附錄pH值測定法，測定其pH值為4.83。

2.2.3 形態(tài)學(xué)[7]研究 采用冷凍蝕刻技術(shù)[5]對PTX ME進行冷凍處理，于透射電鏡下觀察并照相，微乳乳滴呈圓球形，分布均勻。PTX ME冷凍蝕刻電鏡照片見圖1。

2.2.4 粒徑及分布考察[8，9]取PTX ME適量，加5%的葡萄糖注射液或0.9%的氯化鈉注射液分別稀釋10倍，用激光粒度散射儀測定微乳的粒徑及其分布。結(jié)果表明，PTX ME的平均粒徑分別為20.8 nm和20.7 nm，多分散指數(shù)為0.084和0.077，呈Gauss分布，約90%的粒子分布在11～32 nm。PTX ME經(jīng)5%葡萄糖注射液稀釋后的粒徑分布見圖2。

2.2.5 載藥量和包封率的測定 （1）色譜條件:色譜柱為Agilent Tc-C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇-乙腈-水（35∶35∶30），流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為227 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。方法學(xué)[10、11]表明，PTX空白微乳不干擾測定；PTX與NTD的分離度為4.98。線性方程為f＝0.058 3C＋0.011 7（r＝0.999 9，n＝6）。測定日內(nèi)8 h和日間3 d的精密度，RSD分別為0.45%（n＝6）和0.64%（n＝6）；平均回收率為99.80%，RSD＝0.77%（n＝9）。可見，方法的精密度、回收率均較好。PTX的HPLC圖見圖3。

（2）包封率測定[12]:參照2005年版《中國藥典》微囊、微球與脂質(zhì)體指導(dǎo)原則的要求進行本品的包封率測定。①洗脫曲線的考察:將葡聚糖凝膠G50用蒸餾水充分溶脹后裝柱（柱高∶內(nèi)徑＝6∶1），洗脫液為蒸餾水。精密量取微乳（取PTX ME注射液，加5%葡萄糖注射液稀釋10倍）0.5 mL上柱，每1 mL收集1份樣品，然后按“2.2.5（1）”項下色譜條件測定。結(jié)果，微乳于6～13 mL之間流出，游離藥物于16 mL開始流出，微乳與游離藥物能完全分開。②柱層析方法的回收率考察:取微乳0.5 mL上柱后，13 mL前用蒸餾水洗脫，流出13 mL以后用20%乙醇溶液洗脫，收集25 mL內(nèi)的洗脫液，加甲醇定容至25 mL。然后按“2.2.5（1）”項下色譜條件測定洗脫后的藥物總量（W），并測定原上樣0.5 mL微乳中含有的藥物總量（W0），按下式計算:柱回收率（%）＝W/W0×100%。分別按上法上樣0.4、0.5、0.6 mL，結(jié)果，柱回收率分別為99.31%、98.89%、97.11%（n＝3），表明該方法具有較高的回收率。③包封率的測定:按“2.2.5（2）①”項下方法，收集微乳部分的洗脫液，加甲醇定容至25 mL，按“2.2.5（1）”項下色譜條件，測定收集的流出液中的藥物總量W；取同批樣品測定0.5 mL微乳中含有的藥物總量W0；包封率（%）＝W/W0×100%。載藥量和包封率的測定結(jié)果見表3。

表3 載藥量和包封率的測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 3 Drug-loading rate and encapsulated efficiency of PTX ME（±s，n＝3）

表3 載藥量和包封率的測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 3 Drug-loading rate and encapsulated efficiency of PTX ME（±s，n＝3）

批號71201 71202 71203包封率/%97.03±2.54 97.89±1.68 96.24±2.74載藥量/g·L-1 3.032±0.004 2.985±0.003 3.015±0.004

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 （1）配伍試驗:PTX ME在臨床使用時，須用5%葡萄糖注射液或0.9%氯化鈉注射液稀釋后靜脈滴注，因此筆者進行配伍試驗觀察其穩(wěn)定性。結(jié)果，配伍后12 h內(nèi)一直呈略帶乳光的澄清透明溶液，含量、pH值、平均粒徑均無明顯變化，表明該制劑在12 h內(nèi)穩(wěn)定。（2）影響因素考察:①光照試驗:取PTX ME注射液（批號:071201），置于60℃恒溫箱中，4 ℃、光照（4 000～5 000 Lx）放置10 d，分別于0、5、10 d末取樣測定。②凍融試驗:將樣品置于－4℃2 d，再放置于40℃2 d，即凍融1次，連續(xù)循環(huán)3次，考察外觀、pH值、載藥量、粒徑、有關(guān)物質(zhì)[13]。微乳除了在60℃和40℃試驗條件下有關(guān)物質(zhì)略有增加外，其他條件各項指標(biāo)均無明顯變化，表明PTX ME受溫度影響較大，高溫貯藏不穩(wěn)定，應(yīng)低溫放置。PTX ME的穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表4。

表4 PTX ME的穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n＝3）Tab 4 Stability of PTX ME（n＝3）

3 討論

研究中選取的輔料均可供注射用；且選取的最優(yōu)處方中ELP的用量只有3%，相對于市售的PTX注射液（用量為50%）減少了94%，極大降低了過敏反應(yīng)的發(fā)生率。

處方中加入的S-100有利于PTX和形成微乳乳滴的穩(wěn)定性。DOC-Na的加入增加了膜的穩(wěn)定性和PTX的溶解性，阻止了PTX的析出，而且毒副作用小，廣泛用于乳劑型注射劑制備的使用中[14]。筆者將常用的制備脂質(zhì)體和膠束的薄膜分散法和微乳制備方法相結(jié)合應(yīng)用于制備微乳，突破了微乳傳統(tǒng)的制備方法，擴展了新技術(shù)的應(yīng)用范圍，這將為其它藥物微乳的制備提供參考。

色譜條件優(yōu)選中，經(jīng)預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，采用甲醇-乙腈-水（20∶30∶50）[13]的流動相，PTX的出峰時間太慢，保留時間約30 min。通過調(diào)節(jié)流動相的比例，最終確定流動相為甲醇-乙腈-水（35∶35∶30），PTX和NTD的出峰時間可控制在10 min內(nèi)，且能達到很好的分離，能節(jié)省分析時間，提高分析效率。

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