蘄蛇酶聯(lián)合肝素治療對兔下腔靜脈血栓血管內(nèi)膜的影響研究Δ

孫一來，向志，趙渝，鄒中輝，孫一圣（.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科，重慶市40006；.山東省泰山療養(yǎng)院，泰安市 7000）

靜脈血栓形成的病變過程中會伴發(fā)靜脈壁的炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、內(nèi)膜增生等情況，這一系列的病變會促進血栓的形成，影響靜脈血栓的預(yù)后。抗凝、溶栓（TL）是治療下肢深靜脈血栓形成（DVT）的主要方法之一。筆者通過蘄蛇酶聯(lián)合肝素治療兔下腔靜脈血栓，對比尿激酶聯(lián)合肝素及單純應(yīng)用肝素治療方案，探討蘄蛇酶聯(lián)合肝素治療對兔下腔靜脈血栓血管內(nèi)膜、膠原纖維沉積、內(nèi)皮細(xì)胞的影響。

1 材料

1.1 儀器

S-3000N型掃描電鏡（日本Hitachi公司）；ECLIPSE E200型光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 試藥

蘄蛇酶（福建匯天生物藥業(yè)有限公司，批號:080404）；肝素鈉（蘇州新寶制藥有限公司，批號:080409）；尿激酶（廣東麗珠集團麗珠制藥廠，批號:080402）。

1.3 動物

健康新西蘭大白兔72只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供（動物許可證號:SCXK（渝）2007-001）。

2 方法

2.1 模型的復(fù)制

3%苯巴比妥鈉（40 mg·kg-1）靜脈麻醉，游離左腎靜脈與下腔靜脈匯合處和髂總靜脈分叉處之間的下腔靜脈段。分別在左腎靜脈匯合下腔靜脈處下方用1#絲線結(jié)扎下腔靜脈，在髂總靜脈分叉處上方用顯微血管夾暫時阻斷下腔靜脈1.5 h，經(jīng)25 G細(xì)針穿刺無血液流出，證實該段靜脈內(nèi)血栓已形成，血栓形成模型制作成功率為100%。

2.2 分組及給藥

實驗分為3組，即肝素（A）、尿激酶聯(lián)合肝素（B）及蘄蛇酶聯(lián)合肝素（C）組。其中，A、B、C組再分為術(shù)后3、7、10 d 3個時相亞組，每個亞組8只兔子。

2.3 藥物治療

成功復(fù)制模型后3 d，A、B、C組分別于耳緣靜脈注入肝素鈉500 IU·kg-1，尿激酶10 000 IU·kg-1和肝素鈉500 IU·kg-1，蘄蛇酶0.5 IU·kg-1和肝素鈉500 IU·kg-1。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 光鏡下觀察內(nèi)膜變化情況:血栓形成3 d后開始用藥，分別于用藥后第3、7、10天取各組病變的下腔靜脈血管，用生理鹽水將殘余的血栓沖洗干凈，縱行切開血管，從血管中間橫斷，取其中一段標(biāo)本用10%的甲醛溶液固定，采用Masson染色，在光鏡下觀察腔靜脈內(nèi)膜增生情況。

2.4.2 光鏡下觀察膠原纖維沉積情況:觀察Masson染色的腔靜脈血管膠原纖維沉積情況，通過IMS計算機彩色圖像分析系統(tǒng)采集膠原纖維沉積數(shù)據(jù)。

2.4.3 掃描電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞損傷情況:將各組縱行切開的另一段血管用25%戊二醛溶液固定，掃描電鏡觀察各組的內(nèi)皮細(xì)胞損傷情況。電鏡下內(nèi)皮損傷各級表現(xiàn)為Ⅰ級（內(nèi)皮細(xì)胞脫落0～10%，內(nèi)皮層完整×1 000）、Ⅱ級（內(nèi)皮細(xì)胞脫落11%～25%，內(nèi)皮層輕微斷裂伴白細(xì)胞及血小板沉積×1 000）、Ⅲ級（內(nèi)皮細(xì)胞脫落26%～50%，片狀內(nèi)皮脫落，明顯的內(nèi)皮下基質(zhì)顯露×1 000）、Ⅳ級（內(nèi)皮細(xì)胞脫落51%～75%，內(nèi)皮腫脹伴明顯組織壞死×1 000）、Ⅴ級（內(nèi)皮細(xì)胞脫落76%～100%，嚴(yán)重的內(nèi)皮脫落伴明顯的內(nèi)皮下基質(zhì)暴露×1 000）。內(nèi)皮損傷分級見圖1。

圖1 內(nèi)皮損傷分級Fig 1 Endothelium injury degree

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

膠原纖維沉積比例指標(biāo)采用單因素方差分析，內(nèi)皮層損傷分級以等級資料表示，采用多個樣本兩兩比較的秩和檢驗。

3 結(jié)果

3.1 光鏡下腔靜脈內(nèi)膜病理變化結(jié)果

用藥3、7、10 d時，A組的內(nèi)膜增生程度逐漸加重，程度均較B、C組重；B組和C組的內(nèi)膜增生程度較輕，第10天時A組的增生程度較C組重。內(nèi)膜增生情況見圖2。

圖2 腔靜脈內(nèi)膜增生情況Fig 2 Intimal hyperplasia of vena cava

3.2 光鏡下腔靜脈膠原纖維染色面積檢測結(jié)果

用藥3 d時，C組較A組的膠原纖維沉積輕（P＜0.05），其中在7、10 d時，C組和A組有顯著性差異（P＜0.01）；在用藥3、7、10 d時，B組和C組損傷程度均較輕，2組比較無顯著差異（P＞0.05）。各組在用藥后3個時相的膠原纖維染色面積比較結(jié)果見表1。

表1 各組在治療后3個時相的膠原纖維染色面積比較結(jié)果（±s，%）Tab 1 Comparison of collagen fiber staining area of three groups after treatment at three time phase（s±s，%）

表1 各組在治療后3個時相的膠原纖維染色面積比較結(jié)果（±s，%）Tab 1 Comparison of collagen fiber staining area of three groups after treatment at three time phase（s±s，%）

與A組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs.A group:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別A組B組C組7 d 26.36±1.07 22.01±0.831＊＊22.36±0.531＊＊靜脈條數(shù)888 3 d 22.58±0.75 19.40±0.651＊＊20.29±0.642＊10 d 32.25±0.72 28.43±0.771＊＊28.62±0.891＊＊

3.3 腔靜脈內(nèi)皮細(xì)胞掃描電鏡檢查結(jié)果[1]

A組抗凝治療后，內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度隨血栓形成病程進行性增大，給藥3 d時多為Ⅱ～Ⅲ級；給藥7 d時多為Ⅲ級；給藥10 d時多為Ⅲ～Ⅳ級，內(nèi)皮細(xì)胞脫落程度逐漸加重，內(nèi)皮下基質(zhì)暴露明顯。B組和C組溶栓治療后，給藥3 d時多為Ⅱ～Ⅲ級，內(nèi)皮層相對較完整，但細(xì)胞輕度腫脹，細(xì)胞間隙增寬，略有細(xì)胞脫落，內(nèi)皮下基質(zhì)輕微暴露，有少許白細(xì)胞黏附；給藥7 d時多為Ⅱ級，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹減輕，細(xì)胞間隙較前變窄，未見白細(xì)胞黏附；給藥10 d時多為Ⅱ級，有少許達到Ⅰ級，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于正常，內(nèi)皮下未見明顯基質(zhì)。B、C組與A組比較，在溶栓術(shù)后3、7、10 d有顯著性差異（P＜0.01）；B組與C組比較，在溶栓術(shù)后3、7、10 d無顯著差異（P＞0.05）。各組內(nèi)皮細(xì)胞損傷比較結(jié)果見表2；組間不同時相內(nèi)皮損傷比較結(jié)果見表3。

表2 各組內(nèi)皮細(xì)胞損傷比較結(jié)果Tab 2 Comparison of endothelial cell damage among three groups

表3 組間不同時相內(nèi)皮損傷比較結(jié)果Tab 3 The comparison of endothelial cell injury at different phases among groups

4 討論

抗凝、溶栓是目前治療急性下肢深靜脈血栓的主要方法，但外周溶栓治療也加大了大出血的風(fēng)險[2，3]。目前，尿激酶是治療下肢靜脈血栓的主要溶栓藥物，尿激酶和肝素的主要副作用是出血，二者同時應(yīng)用更容易發(fā)生[4]。蘄蛇酶是從尖吻蝮蛇毒中分離、純化的凝血酶樣酶，是用于防止血栓性疾病的新型藥。這種藥品作用于血漿纖維蛋白原，使其轉(zhuǎn)變?yōu)椴环€(wěn)定的纖維蛋白產(chǎn)物。用藥后使纖維蛋白原量下降，凝血酶時間延長，優(yōu)球蛋白溶解時間縮短，血小板解聚，從而阻止血栓的形成，現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。蘄蛇酶主要降解纖維蛋白原，而激發(fā)纖溶系統(tǒng)作用弱，其存在出血的風(fēng)險性較小。

抗凝、溶栓治療還具有較好保護內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用[5，6]。內(nèi)皮細(xì)胞在抑制平滑肌細(xì)胞（SMC）生長及從中膜到內(nèi)膜的移行中起著重要作用；內(nèi)皮細(xì)胞能夠合成抑制SMC生長的類肝素樣物質(zhì)[7]。血栓在形成的過程中會引起靜脈壁發(fā)生炎癥反應(yīng)，而內(nèi)皮細(xì)胞的受損也會失去抗栓作用而導(dǎo)致內(nèi)膜增生，加重靜脈壁的炎癥。可見，內(nèi)皮細(xì)胞在血栓形成、復(fù)發(fā)的過程中具有重要作用。本研究掃描電鏡結(jié)果表明，A組內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度隨血栓形成的病程發(fā)展，第10天時損傷大多在Ⅲ～Ⅳ級，說明單純的抗凝治療并不能有效阻止靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的進一步加劇。尿激酶不僅具有溶解血栓作用，還能減輕血栓引起的血管壁急性炎癥反應(yīng)[8]。C組和B組在用藥后的不同時間段內(nèi)皮損傷程度的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），用藥后第3天內(nèi)皮損傷程度大多為Ⅱ～Ⅲ級，第10天時內(nèi)皮損傷程度大多為Ⅰ～Ⅱ級，說明2組均能夠有效地保護內(nèi)皮細(xì)胞，在療效方面相近，無差異性。蘄蛇酶能夠促進血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織型纖溶酶原激活物（t-PA），溶解內(nèi)皮表面附著的血栓，對減輕血管內(nèi)皮的損傷可能起到一定的作用。本研究光鏡檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在用藥后的不同時相，A組的內(nèi)膜增生程度均較B組、C組嚴(yán)重，并一直保持較高的水平，A組膠原纖維沉積的比例也較B組和C組大，而B組和C組的內(nèi)膜增生程度和膠原纖維沉積的比例無顯著差異，說明C組能夠有效減輕內(nèi)膜的增生，抑制膠原纖維的沉積。

綜上所述，本研究進一步提示了蘄蛇酶聯(lián)合肝素在減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷、避免血小板與內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）接觸而被激活、降低血管內(nèi)膜增生的程度、減輕血管壁急性炎癥方面是有效的，對兔下腔靜脈血栓有著較好的治療及預(yù)后效果，可為靜脈血栓的抗凝、溶栓治療提供一種新的方案。

[1]Cho JS，Martelli E，Mozes G，et al.Effect of thrombolysis and venous thrombectomy on valvular competence，thrombogenicity，morphology，and function[J].J Vasc Surg，1998，28（5）:787.

[2]Schweizer J，Kirch W，Koch R，et al.Short-and long-term results after thrombolytic treatment of deep venous thrombosis[J].J Am Coll Cardiol，2000，36（4）:1 336.

[3]Levine MN，ColdhaberSZ，GoreJM，et al.Hemorrhagic complications of thrombolytic.Therapy in the treatment of myocardial infarction and venous thromboembolism[J].Chest，1995，108（4 suppl）:291S.

[4]蔡清明，賀江南.尿激酶治療下肢深靜脈血栓形成[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，1998，27（7）:437.

[5]Segal JB，Streiff MB，Hofmann LV，et al.Management of venous thromboembolism:a systematicreview for practice guideline[J].Ann Intern Med，2007，146（3）:211.

[6]Cynamon J，Stein EG，Dym RJ，et al.A new method for aggressive of deep veinthrombosis:retrospective study of the power pulse technique[J].J Vasc Intery Radiol，2006，17（6）:1 043.

[7]Davis MR，Ortegon DP，Kerby JD，et al.Endothelial dysfunction after arterial thrombosis is ameliorated by Larginine in combination with thrombolysis[J].J Vasc Intery Radiol，2003，14（2）:233.

[8]Thomas WW，Robert MS，Carol AW，et al.Venous thrombosis associated inflammation and attenuation with neutralizing antibodies to cytokines and adhension molecules[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，1995，15:258.