響應曲面法優化紅葡萄酒中主要芳香物質的SPME-GC分析方法

于 靜，王宏鐳，霍江蓮，李景明，葛毅強*

(1.北京市產品質量監督檢驗所，北京 100071；2.北京市食品研究所茶葉質量監督檢驗站，北京 100162；3.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；4.科技部中國農村技術開發中心農業處，北京 100045)

響應曲面法優化紅葡萄酒中主要芳香物質的SPME-GC分析方法

于 靜1，王宏鐳1，霍江蓮2，李景明3，葛毅強4,*

(1.北京市產品質量監督檢驗所，北京 100071；2.北京市食品研究所茶葉質量監督檢驗站，北京 100162；3.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；4.科技部中國農村技術開發中心農業處，北京 100045)

利用固相微萃取和氣相色譜技術對赤霞珠干紅葡萄酒中的主要香氣成分進行分析，采用單因素和響應曲面法進行試驗設計，以香氣值為研究指標，研究SPME的萃取時間、萃取溫度和電解質(NaCl)的添加量等因素對紅葡萄酒中主要芳香物質的影響。結果表明：最佳分析參數是時間30.50min、溫度45℃、加鹽量0.29g/mL，并對結果進行驗證，在此條件下，香氣值之和提高了6.1。

葡萄酒；芳香物質；固相微萃取；氣相色譜法；香氣值；響應曲面法

香氣是評判葡萄酒品質的一個重要的感官指標。葡萄酒芳香物質的種類、含量、感覺閾值及其之間的相互作用決定著葡萄酒的感官質量，是構成葡萄酒質量的主要因素，決定著葡萄酒的風味和典型性[1]。判斷一種香氣物質在體系中作用的大小，一般用香氣值(odor activity value，OAV)來表示，它是香氣物質的濃度與其閾值的比值。香氣值越大，說明該香氣物質對葡萄酒整體香氣的貢獻率越大[2]。因此，利用香氣值可以更客觀、更完整地評價葡萄酒的香氣物質。

目前葡萄酒中芳香物質的提取主要采用液液萃取[3]和固相微萃取技術，其中固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)是近年來出現的一種全新概念的樣品預處理、濃縮技術，它克服了傳統提取方法的諸多缺陷，具有簡便、靈敏度高、線性及重現性好、樣品處理時間短、分析樣品量少、無需有機溶劑綠色環保等優點[2,4-5]。從熱力學和動力學分析可知，固相微萃取吸附效率的影響因素主要包括萃取溫度、萃取時間和加鹽量[4-5]。

本實驗將紅葡萄酒中具有代表性的14種主要芳香物質(乙酸乙酯、丙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、己醇、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸、苯乙醇、辛酸、癸酸、2-甲基丁酸、丁二酸二乙酯)的香氣值之和作為一個評價指標，閾值參照已有的報道[2,6-7]，采用響應曲面法對萃取時間、萃取溫度和加鹽量3個因素進行優化。目的是縮短提取時間、提高萃取效果，旨在為SPME萃取其他香氣的研究提供參考，為葡萄酒產品質量控制及評定提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

赤霞珠(Cabernet Sauvignon)干紅葡萄酒(2003年)：乙醇含量為12%(V/V) 北京龍徽葡萄酒有限公司。

氯化鈉(分析純)；4-甲基-1-戊醇(98%) 美國Aldrich公司。

HS-SPME取樣裝置、聚丙烯酸酯(polyacrylate，PA)萃取頭 美國Surpelco公司； HP6890氣相色譜儀Agilent公司；DB-WAX色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)美國J&W公司。

1.2 方法

1.2.1SPME的萃取

根據文獻報道[8-10]，選取萃取效果較好的PA萃取頭分析紅葡萄酒中的揮發物質。

葡萄酒香氣成分的萃取：在15mL裝有磁力攪拌器的頂空瓶中加入10mL葡萄酒，分別在不同的萃取溫度、萃取時間和加鹽量條件下吸附，GC進樣口解吸溫度260℃，解吸時間10min，進行GC分析。

1.2.2 氣譜條件

SPME無分流進樣；程序升溫：40℃保持5min，以5℃/min的升溫速度升至230℃，保持10min；載氣N2，流流1mL/min。檢測器溫度260℃，進樣口溫度270℃。

1.2.3 定性、定量方法

根據外標法進行定性分析，見圖1。利用內標法(4-甲基-1-戊醇)進行定量。

圖1 紅葡萄酒主要芳香成分標準樣品的氣相色譜圖Fig.1 GC-Chromatogram of standard sample of representative aromatic components in Cabernet Sauvignon red wine

1.2.4SPME萃取效果單因素試驗

熱力學和動力學分析可知，固相微萃取吸附效率的影響因素主要包括萃取溫度、萃取時間和加鹽量。根據氣譜譜圖分析，結合已有的報道[1,6]。赤霞珠干紅葡萄酒的主香成分主要有乙酸乙酯、丙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、己醇、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸、苯乙醇、辛酸、癸酸、2-甲基丁酸、丁二酸二乙酯，所以這14種化合物是紅葡萄酒中主要香氣成分研究的指標，分別對這3個影響因子作單因素試驗(表1)。

表1 單因素試驗設計Table 1 Factors of single-factor experiments

1.2.5SPME萃取效果的參數優化試驗

采用三因素二次正交旋轉組合試驗設計，在單因素試驗中，已確定SPME參數基礎上對其進行進一步的優化。

預試驗表明，萃取時間、萃取溫度和NaCl加入量是影響主要芳香物質香氣值之和的關鍵因素。因此分別以X1、X2、X3來表示上述關鍵因子(自變量)，1、0、-1代表其高、中、低水平，按方程Xi＝(xi-x0)/Δx對自變量進行編碼。其Xi為自變量的編碼值，xi為自變量的真實值，x0為試驗中心點時自變量的真實值，Δx為自變量的變化間距。二次旋轉回歸因素水平編碼設計見表2。

表2 正交旋轉組合試驗因素水平及編碼Table 2 Factors, levels and codes of orthogonal rotation composite experiments

葡萄酒中主要芳香物質香氣值之和Y為評價指標，即響應值。對應Y的預測模型由最小二乘法擬合的二次多項方程為：

式中：Y為響應值；A0為常數；A1、A2、A3為線性影響系數；A11、A22、A33為平方效應影響系數；A12、A23、A13為交互作用系數。為了求得此方程的各項系數，需15組試驗來求解。模型的準確性通過多元回歸系數R2檢驗，各系數的顯著性進行t檢驗和P檢驗。統計軟件采用美國Statsoft公司STATISTICA 6.0和SAS 8.0，設計及結果見表3。

表3 三因素二次正交旋轉回歸組合設計與結果Table 3 Design and results of orthogonal rotation composite experiments

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 萃取時間的確定

頂空固相微萃取是一種在平衡狀態測定的被分析物的方法，分析物的平衡狀態由分析物在系統三相中的物質分配決定。這三相包括薄膜、頂空和溶液。一旦分析物在三相中達到平衡，它們每一相的質量濃度為一常數。所以要準確測定分析物在薄膜中的質量濃度，首先要使系統達到平衡狀態，該平衡狀態可通過被分析物的萃取時間與峰面積測定，峰面積為常數時的時間為平衡時間，而且通過嚴格控制萃取時間保持一致，即可獲得良好重現性的結果。本實驗選用PA萃取頭，固定其他萃取條件，在NaCl 0.2g/mL加入量、吸附溫度40℃的條件下，分析萃取時間對萃取效果的影響。

結果(表4)顯示，在14種主要芳香成分中有6種是在30min達到吸附最大值，他們是乙酸乙酯、己醇、癸酸乙酯、2-甲基丁酸、辛酸和癸酸；有5種物質在40min達到最高點，分別是丙醇、3-甲基丁醇、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯和苯乙醇；在50min時有兩種物質達到最高點，分別是2-甲基丙醇和己酸；而乳酸乙酯在60min時才達到最大值；在萃取20min沒有香氣物質達到吸附濃度最大值。大部分香氣物質的變化趨勢是先升高后降低，跟理論解釋一致。總體香氣值在萃取30min達到最高值，所以得到在時間單因素試驗中，萃取30min為最佳。14種芳香物質閾值見表4[11-12]。

2.1.2 萃取溫度的確定

萃取溫度對SPME法的影響具有雙重效應：升高溫度有利于香氣物質在葡萄酒中的擴散(提高了香氣成分的頂空分配)，縮短平衡時間、加快分析速度；但是升高溫度使香氣成分在涂層(PA)與葡萄酒中的分配系數降低，萃取頭對香氣成分的吸附量較少，影響SPME的靈敏度。所以應該選擇最佳溫度。同樣在固定NaCl加入量、吸附時間的條件下，分析萃取溫度對萃取效果的影響。

表4 不同萃取時間下紅葡萄酒中主要芳香物質的香氣值(OAV)Table 4 Aroma values of major aromatic components in Cabernet Sauvignon red wine under different extraction time

表5 不同萃取溫度下紅葡萄酒中主要芳香物質的香氣值Table 5 Aroma values of major aromatic components in Cabernet Sauvignon red wine under different extraction temperatures

表6 不同NaCl加入量對下紅葡萄酒中主要芳香物質的香氣值Table 6 Aroma values of major aromatic components in Cabernet Sauvignon red wine under different concentrations of NaCl

從表5可以看出，隨著溫度的升高可，大部分香氣的萃取效率變高，當達到一定溫度后，又呈下降趨勢。在30℃時有4種物質達到吸附最大值，分別是乙酸乙酯、己醇、乳酸乙酯和辛酸乙酯；在40℃時有6種香氣物質達到吸附最大值，它們是丙醇、2-甲基丙醇、癸酸乙酯、2-甲基丁酸、己酸和癸酸；在50℃時，二酸二乙酯和苯乙醇兩種物質達到吸附最大值；在60℃時3-甲基丁醇、辛酸達到最大值。總體香氣值在40℃和50℃萃取條件下，差異不大，但是考慮到單個香氣物質和氣譜圖的峰形，在溫度的單因素試驗中選40℃為萃取溫度。

2.1.3 樣品基質質量濃度的確定

減少被分析物在水溶液的可溶性，能使更多的揮發性物質揮發至溶液的頂空，吸附到纖維頭，從而降低該方法的檢測限，提高香氣物質的響應值，在溶液中加入強電解質無機鹽NaCl，溶液的粒子強度增加，使有機分析物的非極性相對增強并使其在水溶液中的溶解度下降，萃取量得到增加。同時鹽的加入還會影響基質黏度，降低分析物的擴散速度，產生鹽的負效應，所以應該對NaCl的量進行優化。在PA萃取頭，吸附溫度40℃，吸附時間30min的條件下，分析NaCl對萃取效果的影響。

從表6可以看出，在不加NaCl的空白實驗中，只有丁二酸二乙酯達到吸附最大值，說明電解質對其的萃取效果影響不大；當質量濃度是0.1g/mL時，沒有物質達到吸附最大值；0.2g/mL時，有4種物質達到吸附最大，分別是乙酸乙酯、丙醇、2-甲基丙醇和己酸；在0.3g/mL質量濃度時，有9種物質達到吸附最大值，分別是3-甲基丁醇、己醇、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基丁酸、苯乙醇、辛酸和癸酸；在4g/mL質量濃度時，沒有芳香物質達到吸附最高值。總體香氣值在0.3g/mL的質量濃度時，效果比較好。所以在加鹽量單因素試驗中選0.3g/mL為最佳加鹽質量濃度。

2.2SPME實驗條件優化

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗

干紅葡萄酒中主要芳香物質的香氣值之和見表3。

利用SAS軟件對表3中的數據進行多元回歸擬合，獲得主要芳香物質香氣值之和(Y)對自變量萃取時間(X1)、萃取溫度(X2)和NaCl加入量(X3)的二次多項回歸模型方程為：

對該模型進行方差分析，結果見表7，模型系數顯著性檢驗見表8。

表7 回歸模型方差分析表Table 7 Variance analysis of regression equation

表8 回歸方程系數顯著性檢驗表Table 8 Significance test for regression coefficients

由表6方差分析可以看出，FOAV=33.02＞F0.05(9,2)= 19.40，P＜0.05，說明模型方程(2)顯著，不同處理間的差異顯著；FSN＝2.24＜F0.05(9,3)＝8.81，失擬項P＝0.32＞0.05，不顯著；模型的校正決定系數R2Adj=90.95%，說明該模型能解釋約90.95%響應值的變化，僅有總變異9.05%不能用次模型解釋，相關系數R為98.35%，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差下，該模型是合適的，可以用此模型來分析和欲測SPME提取紅葡萄酒主要芳香物質的最優條件。從表7回歸方程系數顯著性檢驗可知：模型(2)一次項X1(P＜0.05)、X3(P＜0.05)顯著；二次項X12(0.0058)、X32(0.0001)顯著；交互項不顯著。

2.2.2SPME萃取效果(葡萄酒中主要芳香物質香氣值總和)的響應曲面分析及優化

由上述結果得出，萃取時間和NaCl加入量是對SPME萃取效果影響最大的因素，其中以NaCl加入量尤為重要。從圖2可以看出，隨著萃取時間的延長，NaCl加入量的增加，萃取效果也顯著增大，當萃取時間和NaCl質量濃度分別在28.75～33.25min和0.285～0.308 g/mL的范圍內時，萃取效果達到最大。萃取時間和NaCl加入量超出這個范圍后，萃取效果降低，這與理論相一致。因為萃取溫度影響不顯著，分析各個溫度段的譜圖，綜合考慮試驗過程中的各種因素，最后確定的萃取溫度45℃、萃取時間30.50min、NaCl加入量0.29g/mL。

圖2 SPME萃取過程中主要香氣物質的香氣值之和與個兩因素的函數關系圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction among two factors on total aroma value of major aromatic components during SPME process

2.2.3SPME優化試驗的驗證

根據響應曲面分析得出的優化條件進行驗證實驗，結果得到5次重復實驗的香氣值范圍為175.6～185.3，均值為180.1，比試驗最高值提高了6.1，這表明在SPME提取條件優化試驗中，響應面法是可靠的方法。

3 結 論

本實驗結合主要芳香物質香氣值之和評價結果，通過響應曲面法進行優化，確定最后的優化條件是萃取時間30.50min、萃取溫度45℃、NaCl加入量0.29g/mL。在此優化條件下，得到了較好的試驗結果，模型具有應用價值。

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SPME-GC Analysis of Aromatic Components in Red Wine by Response Surface Methodology

YU Jing1，WANG Hong-lei1，HUO Jiang-lian2，LI Jing-ming3，GE Yi-qiang4,*
(1. Beijing Products Quality Supervision and Inspection Institute, Beijing 100071, China；2. Station of Tea Quality Supervision and Examination, Beijing Food Research Institute, Beijing 100162, China；3. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；4. China Rural Technology Development Center, Ministry of Science and Technology, Beijing 100045, China)

Major aromatic components in red wine were analyzed by solid-phase micro-extraction and gas chromatography (SPME-GC). Effects of extraction time, extraction temperature and NaCl concentration on major aromatic components in red wine were explored by single-factor and response surface experiments. Results indicated that the optimal parameters of SPMEGC analysis were extraction time of 30.50 min, extraction temperature of 45 ℃ and NaCl concentration of 0.29 g/mL. Under the optimal conditions, total aroma value was increased by 6.1 folds.

red wine；aromatic components；solid phase micro-extraction(SPME)；gas chromatography(GC)；aroma value；response surface design

TS262.6

A

1002-6630(2010)24-0389-06

2010-04-12

于靜(1980—)，女，工程師，碩士，研究方向為食品分析與檢測。E-mail：happyyujing@126.com

*通信作者：葛毅強(1971—)，男，副教授，博士，研究方向為食品科學與工程及其科技管理。E-mail：gyq@crtdc.org.cn