液相色譜串聯質譜法檢測食品中的黃曲霉毒素

鄭 燕，王遠興*，李瑾瑾

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

液相色譜串聯質譜法檢測食品中的黃曲霉毒素

鄭 燕，王遠興*，李瑾瑾

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

為提高黃曲霉毒素的檢測靈敏度，建立快速液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)法對食品中的4種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2進行定性定量分析。樣品粉碎后用體積比為84:16的乙腈-水混合液提取，過濾后通過真菌毒素凈化柱進樣，采用C18柱分離，0.1%甲酸溶液和甲醇做流動相，以60:40比例等度洗脫，質譜在多反應監測(MRM)的正離子模式下進行分析。4種組分在5min內完全分離，而且此方法線性關系良好，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢出限分別是0.012、0.009、0.013、0.007μg/kg，平均加標回收率在80%～95%之間，相對標準偏差小于5%。該方法快速靈敏、準確可靠，其檢出限可滿足歐盟地區嚴格的黃曲霉毒素限量標準。

液相色譜串聯質譜；黃曲霉毒素；食品

黃曲霉毒素(aflatoxins，AFT)是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌代謝產生的一類有毒的真菌毒素[1-2]，廣泛存在于各種食品、農產品和飼料中，嚴重污染著花生、玉米、大米、小麥等糧油產品，甚至堅果、乳制品、酒類和調味品等一些常見食品中也能經常發現有黃曲霉毒素[3-4]。

黃曲霉毒素及其衍生物有20多種，在自然界分布最廣的是B1、B2、G1、G2這4種，它們的基本結構是由一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮(香豆素)組成，前者為基本的毒素結構，后者與致癌性有關，并加強了前者的毒性[5-7]。

黃曲霉毒素是一種毒性極強的劇毒物質，在所有的真菌毒素中，其毒性、致癌性、致突變性、致畸性均居首位，是目前已知致癌物中致癌力最強的一種[8-9]。黃曲霉毒素不僅毒性大、分布廣，而且結構也比較穩定，一般在食物的熱加工過程中都不易被破壞[10-11]，因此給消費者的飲食安全埋下了巨大隱患。

鑒于黃曲霉毒素對人體健康危害巨大，世界各國政府及相關組織紛紛制定了食品中黃曲霉毒素的限量標準和相應的檢測方法。目前檢測黃曲霉毒素的常規方法主要有薄層色譜法、高效液相法、酶聯免疫吸附法[12-13]。但薄層色譜法操作步驟繁瑣、靈敏度低，而且有機試劑用量大、污染嚴重；高效液相色譜法通常使用熒光檢測器，需要將樣品在柱前或柱后進行衍生，分析時間較長；酶聯免疫吸附法雖然前處理過程簡單，但有時易出現假陽性，造成定性結果有一定偏差[14-16]。

近年來，液質聯用技術在食品安全領域得到廣泛應用，它將色譜的高效分離能力和質譜的高靈敏度這兩種優勢結合在一起，可以對很多種類的化合物進行定性定量分析。林建忠[17]和楊靜[18]等分別采用了LC-MS/MS測定食品中的AFB1，張浩等[19]用LC-MS測定了花生中的4種AFT，但卻鮮見用二級質譜對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2同時檢測的報道。所以液質聯用法在分析黃曲霉毒素方面還有較大的提升空間。本研究擬采用先進的快速液相色譜串聯三重四極桿質譜系統，使4種目標化合物高效分離后，能夠準確的定性定量，建立一種能夠同時分析黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生、玉米、芝麻、花生核桃乳飲品、燕麥片市購。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合標準溶液(B1、G1質量濃度均為1μg/mL，B2、G2質量濃度均為0.3μg/mL) 美國Sigma公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)；甲酸(分析純)；超純水 實驗室制備。

1.2 儀器與設備

6430三重四極桿液質譜聯用系統[配有1200高效液相色譜系統、電噴霧離子源(ESI)及MassHunter數據處理軟件] 美國Agilent公司；Mycosep 226真菌毒素凈化柱 美國Romer公司；FA1104電子天平 上海精天電子儀器廠；KQ2200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水儀 Millipore公司。

1.3 儀器參數

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6mm× 50mm，1.8μm)；流動相：0.1%甲酸溶液-甲醇(60:40)；流速：0.4mL/min；柱溫：35℃；進樣量：5μL。

1.3.2 質譜條件

表1 各種黃曲霉毒素的MRM掃描參數Table 1 Parameters for four kinds of aflatoxins in MRM

離子源：電噴霧離子源(ESI)；干燥氣流速：12mL/ min；干燥氣溫度：350℃；霧化氣壓力：50psi；毛細管電壓：4000V；質量掃描范圍(m/z)：100～500；掃描模式：正離子模式；4種黃曲霉毒素的MRM掃描參數見表1。

1.4 樣品處理

稱取25g粉碎好的樣品置于250mL錐形瓶中，加入100mL乙腈-水溶液(84:16，V/V)，高速攪拌3min，用定性濾紙過濾，將濾液通過Mycosep 226真菌毒素凈化柱，收集凈化液。取1.5mL凈化液，過0.22μm濾膜，放入進樣瓶中，待進樣。

1.5 標準曲線及檢測限

將標準品溶液稀釋成幾個不同濃度，按濃度由低到高的順序進樣，在選定的色譜條件和質譜條件下測定，以進樣濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行線性回歸計算，得到4種黃曲霉毒素的線性方程和相關系數。計算3倍信噪比和10倍信噪比時所對應的樣品濃度，分別作為方法的檢出限和定量限。

1.6 精密度和回收率實驗

將每種樣品連續重復進樣5次，測得各組分的峰面積，計算其相對標準偏差(RSD)，來衡量方法的精密度。為考察該方法的準確性，將每種樣品取3份，分別添加不同體積的標準溶液，按照1.4節進行樣品前處理，在1.3.1節的色譜條件和1.3.2節的質譜條件下測定，計算樣品加標回收率。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

由于黃曲霉毒素易溶于甲醇和乙腈，因此先后選用了甲醇、乙腈與水混合做流動相。對于液質聯用系統來說，流動相的選擇不僅要考慮對組分的洗脫能力，而且還需考慮在質譜中是否能促使樣品達到較高的離子化效率[18]。從實驗結果來看，雖然乙腈在液相中的洗脫效果稍強于甲醇，但是用乙腈做流動相時的離子豐度明顯降低，說明乙腈的離子化效率低，所以采用了甲醇作為流動相。為了促進樣品的離子化，本實驗先后在流動相中分別加入了0.1%甲酸、0.1%乙酸和10mmol/L乙酸銨，結果表明加入甲酸時的離子豐度最強，因此最終確定在純水中添加0.1%甲酸以增強離子化效果。

此外還考察了甲醇與水的比例對分析結果的影響。當甲醇與水的比例大于40:60時，4種黃曲霉毒素不能完全分離，這樣會導致不同離子的離子化相互抑制，降低了靈敏度，影響結果的準確性；而水的比例較大時，出峰時間就會延長。結果表明，當甲醇與水相的比例為40:60時，4種黃曲霉素G2、G1、B2、B1在5min內先后出峰，并得到了最佳的分離效果，其MRM模式的總離子流圖見圖1(圖中1、2、3、4分別表示黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1)。

圖1 標準品的MRM總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograph of AFT in the standard solution by MRM

2.2 質譜條件的選擇

黃曲霉毒素是中等極性的物質，所以適合用電噴霧離子源進行離子化。實驗中嘗試了分別采用正、負兩種離子模式，發現正離子模式下的離子化效率明顯高于負離子模式。在全掃描模式下，確定了M＋H作為4種黃曲霉毒素的母離子。子離子掃描時，選擇豐度高而且穩定的離子做定量離子，最終確定了質荷比(m/z)為241、259、243、245的這4個離子分別做B1、B2、G1、G2的定量離子，然后在選擇性離子掃描(SIM)和MRM模式下分別優化裂解電壓和碰撞能，結果見表1。

2.3 標準曲線及檢出限

取不同濃度的標準溶液，按照1.3節中的色譜條件和質譜條件進樣，以峰面積(y)對含量(x)做標準曲線，得到線性方程和相關系數，并根據3倍和10倍信噪比計算檢出限和定量限，結果見表2。

表2 線性方程、線性范圍及檢出限Table 2 Linear regression equations, linear ranges and detection limits of aflatoxins

2.4 精密度和回收率

按照1.6節方法進行精密度和回收率實驗，計算相對標準偏差和加標回收率。精密度實驗結果見表3，RSD值均小于5%；表4是花生樣品的回收率實驗結果，其他幾種樣品的回收率也都在80%～95%，各項數據表明該方法的精密度和回收率都比較良好。

表3 精密度實驗結果Table 3 Precision test of this analytical method for detecting AFT B1, B2, G1and G2

表4 花生樣品的加標回收率Table 4 Recovery rates of AFT B1, B2, G1 and G2 in peanut samples

2.5 實際樣品的檢測

從市場采購了花生、玉米、芝麻、花生核桃乳飲料、燕麥片這5種食品，每種采購3批，然后按照1.4節方法進行樣品前處理，在1.3節儀器條件下測定樣品中黃曲霉毒素的含量。分析結果顯示，花生和玉米中的黃曲霉毒素含量最高，其中一批玉米樣品的黃曲霉毒素總量(黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量之和)高達30μg/kg，而且AFB1占有很高的比例；芝麻中有兩批樣品含1μg/kg的AFB1；而花生核桃乳飲料和燕麥片中未檢出黃曲霉毒素。同時采用國標中的高效液相色譜法進行對比，發現用液質方法檢測出含有黃曲霉毒素的樣品在高效液相色譜這種傳統方法中卻未能檢出，說明新方法的靈敏度明顯優于高效液相色譜法。

3 結 論

本實驗建立了快速液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)法檢測多種食品中的4種黃曲霉毒素，用甲醇與水等度洗脫，在質譜的正離子模式下監測，5min內4個組分完全分離，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢出限可分別達到0.012、0.009、0.013、0.007μg/kg，不僅能滿足我國國標GB 2761—2005《食品中真菌毒素限量》中黃曲霉毒素的限量要求(規定花生、玉米及其制品中的AFB1不得超過20μg/kg)，而且還能達到歐盟的嚴格限量標準(規定直接供人食用的花生、堅果及其制品中AFB1含量不超過2μg/kg，AFT總量不超過4μg/kg)。該方法靈敏度高、準確性好，而且簡單快速、能在短時間內檢測大量樣品，具有較高的實用價值。

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Determination of Aflatoxins in Food by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHENG Yan，WANG Yuan-xing*，LI Jin-jin
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In order to improve detection sensitivity of aflatoxions, a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was established for the simultaneously qualitative and quantitative analysis of aflatoxins B1, B2, G1and G2. Samples were sequentially extracted by acetonitrile-water at a ratio of 84:16 (V/V), cleaned up with multifunctional cleaning column. After injection, the chromatographic separation was achieved on a C18 column using a mobile phase composed of a mixture of 0.1% formic acid and methanol through gradient elution. The analysis was realized by multiple reaction-monitoring modes. Under above conditions, aflatoxins B1, B2, G1and G2could be completely separated in 5 min with an excellent linear relationship. The determination limits for 4 kinds of aflatoxins were 0.012, 0.009, 0.013μg/kg and 0.007μg/kg, respectively. The recovery rate of spiked samples was in the range of 80%-95% with a relative standard deviation less than 5%. This method can provide a rapid, sensitive, accurate and reproducible detection for aflatoxins and its detection limit is sensitive enough to meet the European regulation for aflatoxins.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry；aflatoxins；food

TS207.3

A

1002-6630(2010)24-0385-04

2010-06-30

食品科學與技術國家重點實驗室自由探索資助課題(SKLF-TS-200915)；國家自然科學基金項目(21045006)

鄭燕(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為食品營養學。E-mail：fairy0003@163.com

*通信作者：王遠興(1964—)，男，教授，博士，研究方向為食品質量與安全、食品化學。E-mail：yuanxingwang@ncu.edu.cn