蔬菜發酵劑乳酸菌產生物胺的檢測與評價

田豐偉，孟 甜，丁俊榮，劉小鳴，張 灝，陳 衛*

(江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

蔬菜發酵劑乳酸菌產生物胺的檢測與評價

田豐偉，孟 甜，丁俊榮，劉小鳴，張 灝，陳 衛*

(江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

通過聯合采用聚合酶鏈式反應(PCR)技術和高效液相色譜分析(HPLC)技術對本實驗室篩選保藏的60余株擬準備用于蔬菜發酵的乳酸菌形成生物胺的能力和水平進行檢測和評價。氨基酸脫羧酶基因的PCR檢測結果表明，受檢菌株中有3株組氨酸脫羧酶陽性菌和22株酪氨酸脫羧酶陽性菌；同時，利用HPLC法對受檢乳酸菌在MRS培養基體系和模式蔬菜發酵體系中發酵形成生物胺的水平進行分析。受試乳酸菌在MRS培養基中組胺產生量在4.32～32.15mg/L之間，酪胺產生量在9.22～114.02mg/L之間。在發酵蔬菜體系中，組胺和酪胺的產生量均小于40mg/L。PCR檢測結果與HPLC分析結果具有較好的一致性。

乳酸菌；發酵蔬菜；生物胺；組胺；酪胺；氨基酸脫羧酶；檢測

生物胺是氨基酸在微生物脫羧酶作用下形成的一類堿性低分子質量有機物。食品中生物胺主要是由氨基酸經乳酸菌脫羧形成，而且高濃度的生物胺往往出現在發酵食品中[1]。適量生物胺在體內具有特定的生理活性，過量攝入時會損害健康[2]。Nout等[3]指出組胺和酪胺的最大攝入量應該為50～100mg/kg和100～800mg/kg，酪胺的攝入量超過1080mg/kg會引起嚴重中毒。除了組胺、酪胺本身的作用外，其他生物胺的存在會增強組胺和酪胺的不良作用。因此，很難確定一個標準來衡量生物胺的毒性[4]。目前各國都沒有明確的最大攝入量規定[5]。生物胺是影響發酵和腌制蔬菜產品安全的一個主要風險因素。如何有效檢測與評價乳酸菌產生物胺的能力是開發蔬菜發酵劑時所必須要考慮的一個問題。

目前生物胺的檢測方法主要包括微生物學方法、化學法和分子生物學方法。傳統微生物學方法檢測生物胺產生菌是繁瑣且不準確的，有報道稱乳酸菌在長期保藏中或在合成培養基上生長可能會喪失產生生物胺的能力[6-7]，可能導致使用化學法定量檢測也有失偏頗，而分子生物學方法快速可靠且不依靠培養基，正彌補了其他方法的不足。因為生物胺是脫羧酶作用于氨基酸前體而最終形成的，所以分子生物學法以編碼脫羧酶的基因為目標物進行檢測與研究。聚合酶鏈式反應(PCR)法具有簡便、快速、敏感和專一等特點，已經成為重要的氨基酸脫羧酶基因的檢測方法[8]。以實驗室保藏的60余株乳酸菌為檢測對象，采用PCR技術對其基因組片段進行擴增，檢測其氨基酸脫羧酶基因，并利用HPLC法對乳酸菌在MRS培養基中和蔬菜發酵模式體系中產生物胺的情況進行分析和評價，為蔬菜發酵劑乳酸菌的開發與應用提供必要的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)和雙歧菌屬(Bifidobacterium)等60余株乳酸菌，由江南大學中國工業微生物資源和信息中心、內蒙古農業大學、國立臺灣大學和江南大學食品生物技術研究室提供；酪氨酸脫羧酶陽性對照菌短乳桿菌(L. brevis IOEB 9809) 南京農業大學；組氨酸脫羧酶陽性菌彎曲乳桿菌(L. curvatus GY2512)為本實驗室保藏菌種。實驗菌株來自不同發酵來源，種屬分類、生化性質明確。

1.1.2 培養基與材料

MRS液體培養基 青島海博生物技術有限公司；卷心菜 市售。

1.1.3 試劑

蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、氯化鈉、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、檸檬酸銨、K2HPO4、MgSO4、MnSO4國藥集團化學試劑有限公司。

PCR引物PHDC1/PHDC2(up:5′CCGTGCG GAAACAAAGAAT3′/down:5′CCA AACACCAGC ATCTTCA3′)[9]，P2-for/P1-rev(up:5′GAYATIATI GGIATIGGIYTIGAYCARG3′/down:5′CCRTART CIGGIATIGCRAARTCIGTRTG3′)[9]上海博尚生物技術有限公司；Taq酶、dNTPs 上海皓嘉生物技術有限公司；DNA提取試劑盒(EZ-10 Spin Column Genomic DNA Isolation Kit) 上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

于超低溫冰箱中將甘油保藏乳酸菌取出，以1%體積分數的接種量接種于10mL MRS液體培養基中，37℃培養，傳代兩次，活化乳酸菌備用。

1.2.2 模式蔬菜發酵體系

卷心菜是發酵蔬菜最常用的蔬菜品種，因此選擇卷心菜作為模式蔬菜發酵體系，其具體制作方法如下，選擇潔凈無腐爛的新鮮卷心菜，經清洗、切分、打漿、取汁，離心去除不溶性固形物，然后經115℃殺菌20min，冷卻后以體積分數2%比例接種待測乳酸菌，于37℃發酵12h，待測。

1.2.3 基因組DNA提取

按照基因組提取試劑盒操作說明書進行。

1.2.4PCR檢測脫羧酶基因

據報道，酪胺和組胺是發酵蔬菜中主要的生物胺，因此選擇酪氨酸脫羧酶基因和組氨酸脫羧酶基因作為檢測目標。選擇25μL擴增體系：10×buffer 2.5μL，引物(PHDC1/PHDC2，P2-for/P1-rev)1μL，dNTPs 2.5μL，Taq酶0.5μL，模板DNA1μL。將上述反應液按順序加入0.2mL離心管中，以無菌ddH2O補足至25μL，充分混勻，擴增反應條件：組氨酸脫羧酶PCR擴增程序為：95℃預變性，5min；循環數：30；95℃變性，45s；50℃退火，1min；72℃延伸，35s；72℃終延伸，10min。酪氨酸脫羧酶PCR擴增程序：95℃預變性，5min；循環數：30；95℃變性，45s；55℃退火，1min；72℃延伸，56s；72℃終延伸，10min。

1.2.5PCR產物回收測序及同源性分析

擴增產物經柱式膠回收試劑盒純化后送樣到上海生工測序，測定結果使用NCBI上的Blast進行同源性比對分析。

1.2.6 生物胺的HPLC分析[10]

樣品前處理：樣品與0.06g/mL三氯乙酸等體積混合，靜置提取1h，雙層濾紙過濾，待衍生。

色譜條件：Waters symmetry C18色譜柱(4.6mm× 250mm，5μm)，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序(表1)；流速：1.2mL/min；檢測波長：254nm；進樣量：20μL；柱溫：35℃。

表1 HPLC法檢測生物胺的改進梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution program for biological amine analysis

生物胺混合標樣衍生[11]：取2mL標樣加入1mL 2mol/L NaOH溶液調整pH值至堿性，加入10μL苯甲酰氯水浴30℃衍生處理40min，而后加入2mL飽和NaCl溶液 60℃水浴5min終止衍生化，加3mL乙醚振蕩混合，萃取完全后移取上層有機相至干凈試管，用氮氣吹干后，加1mL甲醇溶解，每個樣品5次平行，取20μL進樣測定生物胺含量。

樣品衍生：衍生步驟同上，衍生后取20μL進樣測定生物胺含量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

分別從生物胺混合標準溶液中準確量取一定量的標準品，配制成0、1.00、5.00、10.0、25.0、50.0mg/L等一系列質量濃度混合標準溶液，采用上述方法衍生，測定，每個質量濃度重復測定5次。采用外標法，將5種生物胺峰面積與相應質量濃度進行線性回歸，繪制校準曲線，各種生物胺的線性關系、相關系數見表2。分析結果表明，該HPLC法測定的4種生物胺標準品，在1.00～50.0mg/L的質量濃度范圍內線性關系良好(R2＞0.998)，證明該方法對測定4種生物胺具有良好的可靠性。

表2 標準曲線的線性方程與相關系數Table 2 Regression equations and correlation coefficients

2.2 組氨酸和酪氨酸脫羧酶基因的PCR檢測和生物胺的HPLC分析結果

再按照試劑盒操作要求進行，提取待檢測乳酸菌菌的基因組，再進行電泳驗證，60余株乳酸菌均得到大小約為2Mb的較清晰的基因組條帶。

以PHDC1/PHDC2、P2-for/ P1-rev為引物，以乳酸菌基因組DNA為模板分別檢測組氨酸和酪氨酸脫羧酶基因，圖1為部分菌株目的脫羧酶基因擴增產物的電泳圖，分別擴增出500bp和900bp左右的條帶。

對組氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶基因擴增產物進行測序，測序結果提交到NCBI上進行Blast比對。表明L.helveticus T16、Lceuconostoc mesenteroides subsp. cremoris 12273、Bifidobacterium bifidum BCRC14615擴增出的序列與Lactobacillus reuteri JCM 1112、Lactobacillus reuteri DSM 20016、Lactobacillus sp. 30a的組氨酸脫羧酶基因序列高度同源，同源性分別高達98%、98%、97%，表明該擴增產物是組氨酸脫羧酶基因。Lactobacillus helveticus C1302、Lactobacillus helveticus D1401，Bifidobacerium bifidum BB-20等22個菌株擴增出的序列與Enterococcus faecium、Enterococcus faecium strain Ef1、Enterococcus faecium strain Ef2 的酪氨酸脫羧酶基因序列高度同源，同源性均高于97%，證明該擴增產物是酪氨酸脫羧酶基因。

圖1 PCR法檢測組氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶基因Fig.1 PCR method to detect the genes of histidine decarboxylase and tyrosine decarboxylation enzyme

對待測乳酸菌在MRS培養基和發酵卷心菜中產生物胺的量進行分析測定，結果見表3。待測乳酸菌產生物胺的HPLC分離效果色譜圖如圖2所示。

圖2 生物胺分離效果色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram for a standard mixture of biological amine

表3和圖2結果表明，在受試菌中有3個菌株具有產組胺的能力，而具有產酪胺能力的菌株為22株，但是不同的菌株生成酪胺的能力差別較大，其原因可能在于酪胺的形成除了受本身基因的影響之外還受基質和環境條件的影響。因為產生生物胺必須包括以下3個條件：存在生成生物胺的前體氨基酸；存在含有氨基酸脫羧酶的微生物；有適宜的環境條件[12]。也就是說有些菌株雖然含有氨基酸脫羧酶基因，但不一定會產生生物胺，還要看是否存在利于產生生物胺的條件。發酵食品中生物胺除去外源性微生物污染外，自身發酵劑的使用不當或發酵環境的控制不好都會引起其在食品中的積累而達到或超過安全限[13]。

生物胺是通過底物和酶反應生成的，廣泛存在于各類食品中，在富含蛋白質和氨基酸的食品中相對更多[14]。據報道，雖然可產生生物胺的微生物并不是廣泛的分布在各個種屬，但是幾乎每個種屬都存在產生物胺的菌株，并沒有種屬特異性。但其產生的量卻千差萬別[15]。此外，食品中生物胺的產生與不良的衛生環境和儲藏條件有關，所以采取相應的措施就可以避免生物胺的產生[16]。未來需要進一步開展關于乳酸菌產生生物胺條件的研究。

通過對NCBI上已報道的乳酸菌組氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶的蛋白和基因序列進行比對，發現來自不同種屬乳酸菌脫羧酶的基因序列高度保守。因此，通過設計合適引物來對乳酸菌脫羧酶基因進行PCR檢測是檢測乳酸菌產生物胺可能性的一種快速高效的檢測方法[9]。PCR檢測表征了乳酸菌是否具有產生物胺的潛在能力，HPLC分析結果直接定量表示發酵體系中有無生物胺的形成或高低，二種方法結合使用能很好的對乳酸菌產生物胺的能力和水平進行評價。在本研究中，對受試菌株而言，PCR結果與HPLC檢測結果具有較好的一致性，因此可以綜合采用兩種方法對乳酸菌是否形成生物胺進行評價和檢測。

表3 部分乳酸菌產生物胺的PCR檢測和HPLC分析結果Table 3 PCR and HPLC results of biological amines produced by different lactic acid bacterial strains

3 結 論

本研究對本實驗室保藏的60余株乳酸菌的氨基酸脫羧酶基因進行PCR檢測，對其產生物胺的潛在可能性做初步分析，篩查出酪氨酸脫羧酶和組氨酸脫羧酶陽性的菌株。利用HPLC法分析待測菌株在培養基體系和蔬菜發酵體系中產生物胺的情況，受試乳酸菌在MRS培養基中產生組胺的含量在4.32～32.15mg/L之間。酪胺產生量在9.22～114.02mg/L之間。而在發酵蔬菜體系中，組胺和酪胺的產生量均小于40mg/L。結果低于美國FDA規定的食品中組胺含量低于50mg/L和酪胺含量高于100mg/L的限量標準要求。

[1]何慶華, 吳永寧, 印遇龍. 食品中生物胺研究進展[J]. 中國食品衛生雜志, 2007, 19(5): 451-454.

[2]PARENTE E, MATUSCELLI M, GARDINI F, et al. Evolution ofmicrobial populations and biogenic amines production in dry sausages produced in southern Italy[J]. Journal of Applied Microbiology, 2001, 90: 882-891.

[3]NOUT M J R. Fermented foods and food safety[J]. Food Research International, 1994, 27: 291-298.

[4]劉辰麒, 丁卓平, 王錫昌. 生物胺的檢測方法評價[J]. 現代科學儀器, 2006(4): 89-91.

[5]SHALABY A R. Significance of biogenic amines to food safety and human health[J]. Food Research International, 1996, 29: 675-690.

[6]LONVAUD-FUNEL A, JOYEUX A. Histamine production by wine lactic acid bacteria: isolation of a histamine-producing strain of Leuconostoc oenos[J]. J Appl Bacteriol, 1994, 77: 401-407.

[7]IZQUIERDO-PULIDO M, CARCELLER-ROSA J M, VIDALCARON M C, et al. Tyramine formation by Pediococcus spp. during beer fermentation[J]. J Food Protect, 1997, 60: 831-836.

[8]MARCOBAL A, de LAS RIVAS B, MORENO-ARRIBAS M V, et al. Multiplex PCR method for the simultaneous detection of histamine-, tyramine-, and putrescine -producing lactic acid bacte-ria in foods[J]. J Food Protect, 2005, 68: 874-878.

[9]LANDETE J M, DE LAS RIVAS B, MARCOBAL A, et al. Molecular methods for the detection of biogenic amine-producing bacteria on foods [J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 117(3): 258-269.

[10]孟甜, 田豐偉, 陳衛, 等. 一種利用RT-HPLC分析乳酸菌產生物胺的方法[J]. 微生物學通報, 2010, 37(1): 141-146.

[11]HWANG Dengfwu, CHANG Shenghsiung, SHIUA Chyuanyuan, et al. High-performance liquid chromatographic determination of biogenic amines in fish implicated in food poisoning[J]. Journal of Chromatography B, 1997, 693: 23-30.

[12]SILLA-SANTOS M H. Biogenic amines: their importance in foods[J]. International Journal of Food Microbiology, 1996, 29: 213-231.

[13]程三寶, 朱俊玲, 馬儷珍. 微生物與發酵食品中的生物胺[J]. 食品工程, 2007(1): 11-13.

[14]蔡成崗, 張慧, 王智敏, 等. 食品中生物胺及其檢測方法研究進展[J].食品研究與開發, 2009, 30(10): 153-156.

[15]MARCOBAL A, MARTI-ALVAREZl P J, MORENO-ARRIBAS M V, et al. A multifactorial design for studying factors influencing growth and tyramine production of the lactic acid bacteria Lactobacillus brevis CECT 4669 and Enterococcus faecium BIFI-58[J]. Research in Microbiology, 2006, 157: 417-424.

[16]HALASZ A, BARATH A, SIMON-SARKADI L, et al. Biogenic-amines and their production by microorganisms in food[J]. Trends in Food Science and Technology, 1994, 5: 42-49.

Detection and Evaluation of Biological Amine Produced by Lactic Acid Bacteria for Vegetable Fermentation

TIAN Feng-wei，MENG Tian，DING Jun-rong，LIU Xiao-ming，ZHANG Hao，CHEN Wei*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

PCR and HPLC methods were used to detect and evaluate the capability of biological amine formation by more than 60 lactic acid bacterial strains. PCR detection of amino acid decarboxylase genes exhibited that 3 and 22 genes from tested strains were positive in histidine decarboxylase and tyrosine decarboxylase, respectively. At the same time, biological amine formation in tested strains was evaluated in MRS liquid media and vegetable fermentation model was determined by HPLC method. The production levels of histamine and tyramine produced by tested lactic acid bacteria in MRS media were 4.32-32.15 mg/L and 9.22-114.02 mg/L, respectively. In fermented cabbage system, production levels of both histamine and tyramine were less than 40 mg/L.

lactic acid bacteria；fermented vegetable； biological amine；histamine；tyramine；amino acid decarboxylase；detection

Q939.97

A

1002-6630(2010)24-0241-05

2010-04-23

國家“863”計劃項目(2007AA10Z353)；“十一五”國家科技支撐計劃項目(2009BAD9B05)；國家自然科學基金項目(20836003)

田豐偉(1976—)，男，講師，碩士，研究方向為食品微生物學。E-mail：fwtian@jiangnan.edu.cn

*通信作者：陳衛(1966—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物學。E-mail：weichen@jiangnan.edu.cn