花果山野生蕨菜多糖和黃酮的提取及含量測(cè)定

夏海濤，劉玉芬，王 蓉，李肖雅

(淮海工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

花果山野生蕨菜多糖和黃酮的提取及含量測(cè)定

夏海濤，劉玉芬，王 蓉，李肖雅

(淮海工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

以連云港花果山野生蕨菜干粉為原料，通過正交試驗(yàn)選擇最佳提取條件，用分光光度法測(cè)定總黃酮和多糖的含量。結(jié)果表明：蕨菜中多糖提取的最優(yōu)條件為蕨菜與水料液比1:20(g/mL)、提取溫度90℃、提取時(shí)間1.5h、提取次數(shù)2次。新鮮蕨菜干粉中多糖含量為1.39%，三月枯蕨菜干粉中多糖含量為7.08%；提取蕨菜中黃酮類物質(zhì)的最優(yōu)條件為蕨菜與70%乙醇比1:10(g/mL)、提取溫度90℃、提取時(shí)間2h、提取次數(shù)2次，測(cè)得新鮮蕨菜干粉中總黃酮含量為4.90%，三月枯蕨菜干粉中總黃酮含量為3.11%。

多糖；黃酮；蕨菜

蕨菜是一種多年生草本植物，喜生于熱帶至亞熱帶地區(qū)，在我國有廣闊的生長區(qū)域，主要分布在華北、西北、西南及華中各省[1]。蕨菜含有十分豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、維生素、胡蘿卜素及微量元素等[1-6]，是一種優(yōu)質(zhì)的綠色天然食品。此外，蕨菜中還含有一些生物活性物質(zhì)如黃酮、多糖、萜類化合物、蕨素A和B等[7]，經(jīng)常食用蕨菜會(huì)有一定的保健作用。目前，研究發(fā)現(xiàn)蕨菜黃酮和多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血脂、抗氧化、抗病毒、抗菌和抗炎等多種藥用保健功能[8-16]，是一類具有廣闊開發(fā)前景的天然抗氧化劑。本實(shí)驗(yàn)以連云港花果山野生蕨菜為原料，對(duì)黃酮和多糖進(jìn)行提取及含量測(cè)定，為花果山野生蕨菜資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕨菜采自連云港花果山，采摘時(shí)間為三月枯蕨菜和新鮮蕨菜，即四月下旬長出地面15～20cm高的蕨菜幼嫩葉(嫩葉拳卷期)，由淮海工學(xué)院化工學(xué)院制藥教研室鑒定。

無水乙醇、丙酮、無水乙醚、硫酸、苯酚、葡萄糖、石油醚(均為分析純) 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品鑒定所。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；SCS1200型超聲儀 上海超聲波儀器有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；RE-5285A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；QY138 索氏提取器 杭州凱豐生物醫(yī)藥有限公司。

1.3 總黃酮和多糖的提取

總黃酮和多糖的提取參照文獻(xiàn)[17-18]方法改進(jìn)。選擇70%乙醇作為黃酮的提取溶劑，在干粉粒度20目、提取次數(shù)2次的條件下，根據(jù)文獻(xiàn)中考察的影響因素，選擇固液比、提取溫度和提取時(shí)間3個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，研究蕨菜中總黃酮和多糖的最佳提取條件。

蕨菜干粉：將新鮮的蕨菜洗凈，在70℃烘至八成干，切成2～3mm碎段，在103℃烘干，粉碎裝瓶備用。

取干燥的蕨菜粉末10g，置索氏提取器中，用石油醚(30～60℃)水浴回流脫脂2次，每次2h。殘?jiān)鼡]干溶劑后進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.1 總黃酮提取正交試驗(yàn)

采用L9(33)正交設(shè)計(jì)表對(duì)提取工藝進(jìn)行考察，即選取固液比、提取溫度和提取時(shí)間3個(gè)因素，按表1進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，其提取工藝流程為：

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of total flavonoids

1.3.2 多糖提取

將提取黃酮后的濾渣在低溫下烘干，按表2進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，其提取工藝流程為：濾渣→熱水浸提→抽濾→提取液→濃縮→乙醇沉淀→離心→干燥→粗多糖。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of polysaccharides

1.4 總黃酮的定性及含量測(cè)定

1.4.1 總黃酮的顏色反應(yīng)

黃酮類物質(zhì)與一些化學(xué)試劑有特殊的顯色反應(yīng)[19]。取樣品乙醇提取液1mL于試管中，加入鎂粉和幾滴濃鹽酸，加熱后溶液泡沫處顯紫色；向樣品乙醇提取液中滴加氯化鐵溶液，提取液顯墨綠色。這些顏色反應(yīng)表明提取液中含有黃酮類化合物。

1.4.2 總黃酮的含量測(cè)定

黃酮含量測(cè)定按文獻(xiàn)[20]方法進(jìn)行。

精密稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁對(duì)照品10mg，用70%乙醇定容至100mL。精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。以不加蘆丁的空白管為對(duì)照調(diào)零，在200～600nm進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在370nm處有最大吸收峰。故本實(shí)驗(yàn)于370nm處測(cè)吸光度，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確稱取103℃干燥至質(zhì)量恒定的粗黃酮粉20～30mg，用70%乙醇溶解，定容。取一定體積樣品液按標(biāo)準(zhǔn)曲線相同方法操作測(cè)得吸光度后，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出黃酮含量。

1.5 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[21]。

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖100mg置100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取該溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mL分別置于10mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容至刻度。按文獻(xiàn)方法操作，室溫顯色40min。在490nm處測(cè)定吸光度，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 多糖含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取10mg左右提取的粗多糖干粉，加水溶解并定容至50mL，取2.0mL于具塞試管中。按1.5.1節(jié)方法操作，測(cè)量吸光度后。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算粗多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮提取溶劑的選擇

黃酮提取方法有多種，如溶劑提取法、超聲波法、微波法、超臨界流體萃取法等。在這些提取方法中，溶劑提取法操作簡單、成本低、較為常用。其提取溶劑有甲醇、丙酮、乙醇等。在這些常用的提取溶劑中，甲醇毒性較大，丙酮的黏度較大，滲透率不高，而乙醇相對(duì)而言毒性較小、選擇性較好、滲透性強(qiáng)，故本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為提取溶劑。在提取時(shí)間1h、固液比1:9(g/mL)、提取溫度80℃時(shí)，采用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的提取結(jié)果見圖1。從圖1可見，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃酮提取量增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%～80%時(shí)，提取量最大，乙醇體積分?jǐn)?shù)再增加時(shí)，提取含量降低，根據(jù)有機(jī)溶劑“相似相溶原理”，黃酮的溶出度與溶劑的極性和本身的極性相關(guān)，極性相似可達(dá)到最大溶出度。所以選擇70%乙醇作為黃酮的提取溶劑。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effect of alcohol concentration on extraction rate of total flavonoids

2.2 干粉粒度對(duì)黃酮和多糖提取的影響

將干燥的蕨菜粉碎，分別過篩，收集100、80、60、40、20目的顆粒，脫脂后用70%乙醇作溶劑，按1:10(g/mL)的料液比投料，在90℃條件下提取2h，按1.4.2節(jié)方法測(cè)定總黃酮含量。將提取黃酮后的濾渣烘干后，按蕨菜干粉:水=1:20(g/mL)的比例投料，在90℃條件下提取1.5h。結(jié)果如圖2所示，所選粒度對(duì)黃酮和多糖提取率的影響差異不大，綜合考慮生產(chǎn)成本和能源等因素，在正交試驗(yàn)中將不考慮干粉粒度這一因素。在后續(xù)試驗(yàn)中均采用直接過20目篩的蕨菜干粉作為研究對(duì)象。

圖2 干粉粒度對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of granule size on extraction rates of total flavonoids and polysaccharides

2.3 提取次數(shù)對(duì)黃酮和多糖提取的影響

圖3 提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction repeat number on extraction rates of total flavonoids and polysaccharides

按2.2節(jié)條件考察不同提取次數(shù)對(duì)黃酮和多糖提取的影響，結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，在給定的條件下，隨著提取第次的增多，總黃酮和多糖含量明顯下降，說明蕨菜中殘留的黃酮和多糖類物質(zhì)已經(jīng)很少，增加提取次數(shù)已無意義，因此把提取次數(shù)定為2次。經(jīng)驗(yàn)試，該條件下總黃酮的率為3.11%。

2.4 蕨菜中黃酮提取正交試驗(yàn)

2.4.1 黃酮提取條件的選擇

根據(jù)正交試驗(yàn)因素水平表(表1)，對(duì)影響黃酮類化合物提取效果的3個(gè)因素進(jìn)行考察，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，確定最佳的提取條件，正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析見表3、4。從表3中極差值可知，3個(gè)因素對(duì)黃酮含量的影響大小依次為A＞B＞C，即固液比＞提取溫度＞提取時(shí)間，最佳提取條件為A3B2C2，即將蕨菜與70%乙醇按1:10(g/mL)的比例投料，在90℃的條件下提取2次，每次提取2h，所得總黃酮的含量最高。經(jīng)試驗(yàn)，該條件下總黃酮得率為3.11%。

表3 黃酮提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Result analysis of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of total flavonoids

表4 黃酮提取試驗(yàn)方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of total flavonoids

2.4.2 多糖提取條件的選擇

通過正交試驗(yàn)因素水平表(表2)，考察影響多糖提取的因素，確定最佳提取條件，多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析見表5、6。從表6可知，固液比對(duì)多糖含量的影響較大，由方差的大小分析得出，各因素對(duì)多糖提取效果影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C，即固液比＞提取溫度＞提取時(shí)間。由極差分析可得，多糖的最佳提取條件為A3B2C3，即將蕨菜與水按1:20(g/mL)的比例投料，在90℃條件下提取2次，每次提取1.5h。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，該條件下多糖得率為7.08%。

表5 多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Result analysis of orthogonal experiments for optimizingextraction conditions of polysaccharides

表6 多糖提取試驗(yàn)方差分析表Table 6 Variance analysis of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of polysaccharides

2.5 總黃酮含量的測(cè)定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.4.2節(jié)方法操作，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A = 0.00267＋0.03154C，相關(guān)系數(shù)r = 0.9998。表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線在測(cè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 蕨菜的總黃酮含量

將樣品的吸光度代入回歸方程，計(jì)算粗黃酮中的黃酮含量，進(jìn)而計(jì)算出蕨菜干粉的總黃酮含量。三月枯蕨菜干粉中總黃酮含量為3.11%，新鮮蕨菜干粉中總黃酮含量為4.90%。

2.6 多糖含量的測(cè)定

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A = 0.00129＋0.01339C，相關(guān)系數(shù)r = 0.9989。將樣品的吸光度代入回歸方程，計(jì)算粗多糖中的多糖含量，進(jìn)而計(jì)算出三月枯蕨菜干粉中多糖含量為7.08%，新鮮蕨菜干粉中多糖含量為1.39%。

3 結(jié) 論

正交試驗(yàn)對(duì)蕨菜多糖和黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明固液比是蕨菜多糖和黃酮提取的重要影響因素，其次是溫度，因此在提取時(shí)應(yīng)注意控制固液比和溫度。蕨菜中黃酮和多糖含量的分析結(jié)果表明蕨菜是獲取多糖和黃酮類化合物的良好來源。本實(shí)驗(yàn)建立的提取工藝成本較低，可作為工業(yè)化大生產(chǎn)提取黃酮和多糖的參考。蕨菜作為一類野生的天然綠色植物資源具有一定的潛在開發(fā)價(jià)值。

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Extraction and Content Determination of Polysaccharides and Flavonoids from Wild Pteridium aquilinum

XIA Hai-tao，LIU Yu-fen，WANG Rong，LI Xiao-ya
(School of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

The optimal extraction processing of polysaccharides and total flavonoids from wild Pteridium aquilinum powder collected from Huaguo Mountain of Lianyungang were explored by orthogonal experiments. The contents of total flavonoids and polysaccharides were determined by spectrophotometry. The optimal extraction conditions for polysaccharides were materialliquid ratio of 1:20, extraction temperature of 90 ℃, extraction repeat number of 2 and extraction time of 1.5 h each time. Under the optimal extraction conditions, the contents of polysaccharides in fresh Pteridium aquilinum and dry Pteridium aquilinum were 1.39% and 7.08%, respectively. The optimal extraction conditions for total flavonoids were material-70% ethanol ratio of 1:10, extraction temperature of 90 ℃, extraction repeat number of 2 and extraction time of 2 h each time. Under the optimal extraction conditions, the contents of total flavonoids in fresh Pteridium aquilinum and dry Pteridium aquilinum were 4.90% and 3.11%, respectively.

polysaccharide；flavonoids；Pteridium aquilinum

TS247

A

1002-6630(2010)24-0124-04

2010-08-03

夏海濤(1960—)，男，教授，碩士，主要從事應(yīng)用化學(xué)及分析化學(xué)研究。E-mail：xht161006@hhit.edu.cn