水溶性大豆多糖的提取工藝研究

王立峰，鞠興榮，何 榮，劉 穎，耿 菁，袁 建

(1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210003；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

水溶性大豆多糖的提取工藝研究

王立峰1,2，鞠興榮1，何 榮1,2，劉 穎1，耿 菁1，袁 建1

(1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210003；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

以脫脂豆粕為材料，對豆粕中水溶性大豆多糖的提取、純化進行研究。通過酶提取效果選擇，在木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶3種酶中選取提取效果最佳的堿性蛋白酶；通過從提取溶液的pH值、提取時間、料液比、酶的添加量及提取溫度等因素的試驗分析比較，得出大豆多糖的最優提取條件。結果表明：當提取溶液pH值、提取溫度、提取時間和液料比分別為6.0、50℃、1.5h和20:1(mL/g)時，豆渣中大豆多糖的提取率可達到最大值17.92%，粗多糖的純度為86.32%。

水溶性大豆多糖；酶法提取；純化

水溶性大豆多糖是以大豆或大豆粕為原料，經脫脂、提取、脫色、純化、干燥等工藝生產的水溶性多糖類物質。其主要成分的分子質量在6×105D左右，由半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、海藻糖、木糖以及葡萄糖等分子組成[1]。

水溶性大豆多糖具有多種生物活性，是一種天然的功能成分，可抑制脂類氧化[2]和穩定酸性飲料中的蛋白質[3]，它可以改善食品的食用品質、加工特性和外觀特性。水溶性大豆多糖黏性低，可制成高濃度溶液，其溶液的黏度幾乎不受鹽類影響，對溫度的熱穩定性也優于其他糖類[4]。另外，干燥大豆多糖時，有強的黏附性，且能形成薄膜，所以大豆多糖可作為涂層材料使用[5]。水溶性大豆多糖有分散性、穩定性、乳化性和黏著性等多種功能，不僅能用作強化食品的膳食纖維素，還可以用于制藥工業中[6]。

關于可溶性大豆多糖的提取，國內外已有很多報道。有的研究了在中性pH值條件下從熱水中提取，有的在堿性條件用熱水提取，有的還添加了絡合劑，在酸性條件下提取[7]。Takahashi等[8]從大豆子葉中用中性熱水提取大豆多糖，得率為38%。Kawamura等[9]則在熱水中逐漸加入草酸銨和質量分數0.5% NaOH溶液，提取的大豆多糖得率為32%。堿水解法提取的大豆多糖為水不溶性，用氯乙酸對其結構進行化學改性獲得的羧甲基大豆多糖具備水溶性和成膜性，有望在制備腸溶膠囊中部分取代褐藻膠。但是這些可溶性多糖多數是從大豆子葉或其他部位提取出來的，提取率不高，工藝比較復雜，成本也比較高。為開發水溶性大豆多糖的利用新途徑，從豆渣中提取水溶性大豆多糖能提高豆渣的利用率，降低大豆產品的生產成本，具有良好的應用前景[10]。酶技術是一種新型高效綠色提取技術，具有快速、高效、反應溫和、專一性強等諸多優點，酶法提取多糖也越來越得到廣泛應用。何玉紅[11]通過復配酶法從豆渣中提取水溶性大豆多糖。酶提法的優勢越來越受研究者的關注，有很多關于各種酶在多種多糖提取中的應用的報道。本實驗以脫脂豆粕為材料，對豆粕中水溶性大豆多糖的酶法提取、純化等方面進行研究，增加企業效益和社會環境效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用東北優質大豆，于粉碎機中粉碎，將豆粕在索式抽提器上用石油醚(30～60℃沸程)于60℃對粉碎后的豆粕回流72h進行脫脂處理，處理后的脫脂豆粕放置在通風處進行脫溶，使石油醚揮發完全后放于旋風磨中磨成細小粉末，所得即為實驗所需原料。

葡聚糖(MW500000) 美國Sigma公司；木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶 丹麥Novozymes公司；檸檬酸三鈉、無水硫酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸銅晶體、次氯酸鈉、95%乙醇、苯酚、濃硫酸、丙酮、石油醚(30～60℃沸程)均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠；THZ-C恒溫振蕩器江蘇太倉實驗設備廠；pHS-3C精密數顯pH計 上海精密科學儀器廠；UV-2401PC紫外分光光度計 日本島津公司；減壓過濾裝置 江蘇太倉實驗設備廠；錘式旋風磨 上海安亭科學儀器廠；索氏抽提器 南京玻璃儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 葡聚糖標準曲線的測定[12]

精密吸取葡聚糖標準使用溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL(相當于葡聚糖0、0.04032、0.08064、0.12096、0.16128、0.2016mg)，分別置于25mL比色管中，定容至2.0mL，加入苯酚溶液2.0mL，在旋轉混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10mL，于旋轉混勻器小心混勻，置沸水浴中煮沸15min，冷卻后用分光光度計在485nm波長處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度。

以葡聚糖質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪標準曲線，其回歸方程Y=10.715X-0.1445，相關系數R2=0.9989。

1.3.2 樣品中總糖量的測定

采用苯酚-硫酸比色法[13]測定大豆中多糖的含量，并以葡聚糖為標準品，通過已經測定的葡聚糖標準曲線計算大豆中的多糖含量。

1.3.3 大豆多糖的酶法提取

分別選用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶，在各自的最適溫度和pH值條件下，添加質量分數0.3%、液料比20:1(mL/g)，提取3h，測定多糖的純度及提取率。依照1.3.2節測定提取出的大豆粗多糖的含量，根據3種酶提取出的大豆水溶性多糖的提取率和提取純度，選擇提取效果最佳的堿性蛋白酶進行正交試驗。

1.3.4 酶法提取水溶性大豆多糖的正交試驗設計

以提取溶液的pH值、提取溫度、提取時間、液料比作為優選4因素，選用四因素三水平正交表L9(34)，各因素的水平根據所選用酶的最佳活性條件選定。

表1 復配酶提取正交試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction processing parameters using compound enzyme

1.3.5 水溶性大豆粗多糖的脫色[14]

向水溶性大豆多糖粗品中加入3倍體積的質量分數10%次氯酸鈉溶液，并調節混合溶液至pH10～11范圍內，在室溫下攪拌40min，粗多糖脫色，將溶液倒入離心管中，置于離心機中(4000r/min)離心15min后，棄去上清液，得到沉淀。濾渣用熱的去離子水洗至溶液呈中性，再置于離心機中(4000r/min)離心15min后，棄去上清液，得到沉淀。濾渣依次用95%乙醇和丙酮清洗一次，瀝干，得到淡黃色水溶性大豆多糖，且略帶香味。

1.3.6 水溶性大豆粗多糖的純化[15]

將大豆水溶性粗多糖溶于適量蒸餾水中，加入1/5體積氯仿和1/15體積正丁醇，振蕩一定時間后，使蛋白質與氯仿-正丁醇生成絮狀凝聚物，用離心機(4000r/ min)離心15min除去沉淀。取離心后的上清液，加入3～5倍體積的95%乙醇沉淀，將沉淀液于4000r/min離心機中離心15min。倒出上清液，將沉淀用95%乙醇、丙酮依次洗滌，60℃真空干燥得到大豆多糖。

2 結果與分析

2.1 樣品中多糖含量的確定

按照1.3.2節方法，對樣品中多糖含量進行測定，得出樣品中的多糖含量為20.82%。

2.2 提取條件對水溶性大豆多糖提取的影響

以水溶性多糖純度為指標，多糖提取率為參考指標，對中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶進行篩選，實驗結果見表2。

表2 不同種類的酶對豆粕中多糖純度及提取率的影響Table 2 Effect of enzyme type on extraction rate and purity of SSPS from soybean meal

由表2可知，堿性蛋白酶提取效果最好，所得的多糖純度為84.0%，提取率達16.2%，其次為木瓜蛋白酶。因此，選擇堿性蛋白酶進行水溶性大豆多糖的提取實驗。

2.3 正交試驗法確定水溶性大豆多糖的最佳提取條件以多糖純度為指標，多糖提取率為參考指標，采用L9(34)來確定最佳條件。堿性蛋白酶提取正交試驗因素與水平表見表1。正交試驗及結果見表3。

表3 提取正交試驗設計及結果Table 3 Design and results of orthogonal experiments for optimizing extraction processing parameters using compound enzyme

從多糖提取率來看，通過方差分析得出影響多糖提取率的因素按影響大小依次為B＞C＞A＞D。表明提取溶液的提取溫度對大豆粕中水溶性大豆多糖的提取結果影響最大，其次是pH值和提取時間，液料比的影響最小。方差分析結果(表4)表明，提取溶液pH值、提取溫度和提取時間對多糖提取率的影響達到顯著水平，而液料比對多糖提取率的影響不顯著，理論最佳工藝條件為A1B2C2D2，即堿性蛋白酶提取水溶性大豆多糖的最佳工藝條件為pH6.0、提取溫度50℃、提取時間1.5h、液料比20:1(mL/g)。在此條件下，大豆粕中水溶性大豆多糖的提取率為17.92%。

表4 提取正交試驗結果方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments for optimizing extraction processing parameters using compound enzyme

從多糖純度來看，由方差分析的結果可知，影響多糖純度的主次順序為C＞A＞B＞D，即提取時間＞提取溶液pH值＞提取溫度＞液料比，且提取時間對多糖提取純度的影響達到極顯著水平，提取溶液的pH和提取溫度對多糖提取純度的影響達到顯著水平，而液料比對多糖提取純度的影響不顯著，其最佳組合為A2B3C2D2，即堿性蛋白酶提取水溶性大豆多糖的最佳工藝條件為提取溶液pH7.0、提取溫度60℃、提取時間1.5h、液料比20:1(mL/g)。在此條件下，豆渣中水溶性大豆多糖的提取純度為85.78%。

通過驗證性實驗，多糖提取率的正交試驗中有A1B2C2D2，其值在9組試驗中也是最大；多糖純度的正交試驗中無A2B3C2D2，以A2B3C2D2為條件測得多糖純度為85.78%，與正交試驗的9組試驗比較，低于A1B2C2D2測得的多糖純度86.32%。采用正交試驗對豆渣中水溶性大豆多糖的提取過程進行研究，結果從表4可以直觀看出，2號試驗A1B2C2D2多糖的提取率和提取純度都是最高的，所以在提取過程中的優化條件為提取溶液pH6.0、提取溫度50℃、提取時間1.5h、液料比20:1(mL/g)的情況下可以得到最佳效果。

3 結 論

本實驗以大豆粕為原材料，通過單因素實驗和正交試驗分別確定了酶法提取水溶性大豆多糖的酶的種類和研究了提取溶劑的pH值、提取溫度、提取時間、料液比等對水溶性大豆多糖的提取量變化的影響，結果表明：在提取溶劑pH值、提取溫度、提取時間和液料比分別為6.0、50℃、1.5h和20:1(mL/g)時，大豆中水溶性大豆多糖的提取率可達到最大值17.92%，同時多糖的純度達到了86.32%。

[1]張倩. 水溶性大豆多糖的提取、鑒定及生物活性的研究[D]. 合肥:合肥工業大學, 2008.

[2]MATSUMURA Y, EGAMI M, SATAKE C, et al. Inhibitory effects of peptide-bound polysaccharides on lipid oxidation in emulsions[J]. Food Chemistry, 2003, 83(1): 107-119.

[3]NAKAMURA A, YOSHIDA R, MAEDA H, et al. The stabilizing behaviour of soybean soluble polysaccharide and pectin in acidified milk beverages[J]. International Dairy Journal, 2006 16(4): 361-369.

[4]徐啟紅, 任平國. 豆渣中水溶性大豆多糖的提取工藝研究[J]. 大豆科學, 2008, 27(5): 41-43.

[5]李勇. 大豆多糖的性質及其在冷凍食品中的應用[J]. 冷凍與速凍食品工業, 2006(7): 21-22.

[6]NAKAMURA A, FURUT H, KATO M, et al. Effect of soybean soluble polysaccharides on the stability of milk protein under acidic conditions [J]. Food Hydrocolloids, 2003, 17: 333-343.

[7]FURUTA H, TAKAHASHI T, YOBE J, et al. Extraction of watersoluble soybean polysaccharides under acidic conditions[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1998, 62(12): 2300-2305.

[8]TAKAHASHI T, MAEDA H, AOYAMA T, et al. Physiological effects of water-soluble soybean fiber in rats[J]. Bioscience Biotechnology Biochemistry, 1999, 63(8): 1340-1345.

[9]KAWAMURA S, NARASAKI T. Study on carbohydrate of soybean: component sugars of fractioned polysaccharides, especially identification of fucose in some hemicelluloses[J]. Agriculture Biology Chemistry, 1961, 25: 527-531.

[10]MULLIN W J, XU W. A study of the intervarietal differences of cotyledon and seed coat carbohydrates in soybeans[J]. Food Research International, 2000, 33(10): 883-891.

[11]何玉紅. 豆渣中水溶性大豆多糖的提取及其在面包中的應用[D]. 合肥: 合肥工業大學, 2007.

[12]胡居吾, 范青生, 肖小年. 粗多糖測定方法的研究[J]. 江西食品工業, 2005(8): 39-42.

[13]周艷紅, 金征宇. 大豆皮果膠多糖的提取工藝研究[J]. 食品工業科技, 2004(3): 55-58.

[14]張蕓蘭. 復合酶法提取冬瓜多糖的研究[J]. 廣西民族大學學報: 自然科學版, 2009(5): 46-49.

[15]李粉玲, 蔡漢權, 嚴贊開, 等. 酶法提取蘆根多糖的研究[J]. 食品工業科技, 2009(4): 156-159.

Extraction Processing of Soluble Soybean Polysaccharides

WANG Li-feng1,2，JU Xing-rong1，HE Rong1,2，LIU Ying1，GENG Jing1，YUAN Jian1
(1. Key Laboratory of Grain and Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Soybean meal was used as the experimental subject to explore the extraction and purification of soluble soybean polysaccharides (SSPS). During the choice of enzyme, alkali protease exhibited the best enzymatic extraction efficiency among papain, alkali protease and complex protease. The optimal extraction conditions of SSPS were explored by evaluating the effects of extraction pH, extraction time, material-liquid ratio, enzyme addition amount and extraction temperature on extraction rate. Results indicated that the optimal extraction conditions were extraction pH of 6.0, extraction temperature of 50 ℃, extraction time of 1.5 h and material-liquid ratio of 1:20. Under these optimal extraction conditions, extraction rate of SSPS was up to 17.92 % and the purity of SSPS was 86.32%.

soluble soybean polysaccharides (SSPS)；enzymatic extraction；purification

TQ936.16

A

1002-6630(2010)24-0111-04

2010-08-19

江蘇省教育廳產業化推進項目(JH09-2)

王立峰(1977—)，男，講師，博士研究生，研究方向為食品營養及功能性成分。E-mail：wanglifeng_8@163.com