動態超高壓微射流預處理對香菇多糖得率的影響

姜 穎，涂宗財*，陳 媛，王 強，李 志，尹月斌

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

動態超高壓微射流預處理對香菇多糖得率的影響

姜 穎，涂宗財*，陳 媛，王 強，李 志，尹月斌

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

為拓展動態超高壓微射流均質技術的應用，采用該技術對香菇子實體進行預處理，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗預處理條件優化，通過實驗組和對照組的對比分析，研究此預處理方法對香菇多糖得率的影響。結果表明：動態超高壓微射流在140MPa、料液比1:60(g/mL)條件下多糖得率達到最高值6.755%。與對照組相比，實驗組香菇多糖提取效率改善顯著。

動態超高壓微射流；香菇多糖；預處理；提取

香菇多糖，是一種從香菇中提取的β-(1→3)-D-葡聚糖，是可激活人體免疫系統的、具有顯著抗腫瘤作用的生物活性大分子[1]。最早是由日本學者Chihara等[2]通過乙醇和正十六烷基三甲基氫氧化銨分級沉淀，及醋酸分步溶解，DEAE樹脂純化而得到的。通常其提取方法可分為兩大類，一類是溶劑(水、稀堿、聚乙二醇)浸提；另一類是使用超聲和超高壓輔助提取[3]。

國內動態超高壓微射流技術較多運用于生物大分子的改性研究中，其對卵清蛋白、花生球蛋白的結構及功能性質的影響已有研究[4-5]；Liu等[6-7]研究該處理對多酚氧化酶的影響。國外Tunick等[8]研究其對干酪微結構的影響；Lagoueyte等[9]研究微射流均質技術對黃原膠功能性質的影響；Dalgleish等[10]研究經超高壓微射流均質后牛奶脂肪顆粒及酪蛋白的變化情況。關于動態超高壓微射流對有效成分提取的影響，鮮有報道。涂宗財等[11]研究動態超高壓微射流處理對玉米花粉破壁效果和多糖得率的影響。本研究以此技術作為預處理方法，考察其對香菇多糖提取的影響，擬為此技術的應用開辟新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干香菇子實體(干燥粉碎后過100目篩備用) 市購；苯酚、無水乙醇、乙醚、丙酮 天津市大茂化學試劑廠；濃硫酸 上海試劑化學有限公司；無水葡萄糖 廣東汕頭市西隴化工廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

M-110EH型微射流均質機 美國Microfluidics公司；FreeZone 4.5 Litter真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；TDL-5-A臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；小型均質機 上海東華高壓均質機廠。

1.3 方法

1.3.1 預處理方法的建立

實驗組預處理方法：5g香菇原料分散于設定比例的水中，經30MPa高壓均質5min后，在預設壓力及次數條件下，過M-110EH型微射流均質機，備用。

對照組預處理方法：5g香菇原料分散于設定比例的水中，經30MPa高壓均質5min，備用。

1.3.2 香菇多糖的提取[2,12-13]

樣品預處理后，在一定溫度下，水浴提取一定時間，離心(4000r/min、10min、20℃)得上清液；Sevag法[14]脫蛋白，流水透析(8000～14000D)2d，蒸餾水透析1d；45℃下旋轉蒸發濃縮；4℃無水乙醇沉淀2h，并使乙醇最終體積分數達到75%；離心(4000r/min、10min、20℃)得沉淀；45℃水浴去離子水復溶沉淀；離心(10000r/min、0.5h、20℃)取清液；丙酮逐滴加入，至丙酮與上清液終體積比1:1；離心(4000r/min、10min、20℃)得沉淀；無水乙醇洗滌沉淀兩次，乙醚洗一次；冷凍干燥得香菇多糖。

1.3.3 香菇多糖得率的測定

以D-葡萄糖為標準，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[15]?；貧w方程為：A=0.0076C-0.0105，R2=0.9993。

1.3.4 微射流處理壓力對香菇多糖得率的影響

動態超高壓微射流處理壓力的變化范圍60～160MPa，變化梯度為20MPa，其他條件為料液比1:60 (g/mL)、微射流處理次數2次、提取時間2h、提取溫度90℃。提取結束后考察預處理壓力對香菇多糖得率的影響。

1.3.5 微射流處理次數對香菇多糖得率的影響

處理次數的變化范圍1～5次，變化梯度為1次，其他條件處理壓力140MPa、料液比1:60(g/mL)、提取時間2h、提取溫度90℃。提取結束后考察預處理次數對香菇多糖得率的影響。

1.3.6 實驗組與對照組的比較

在不同時間段內，不同料液比以及不同溫度下，以香菇多糖得率為響應值，實驗組與對照組比較分析，證明實驗組預處理方式對提高多糖得率的效果顯著。

1.3.7 動態超高壓微射流預處理提取香菇多糖條件優化

為評價動態超高壓微射流預處理對香菇多糖提取效率的影響，在單因素試驗基礎上，選取微射流處理壓力(A)、料液比(B)、提取溫度(C)三因素三水平(表1)，且不考慮各因素之間的交互作用，以香菇多糖得率為響應值，采用正交試驗助手軟件(Sharetop軟件工作室)做數據分析。

表1 動態超高壓微射流預處理提取香菇多糖正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.8 數據分析

所有實驗重復5次，采用SPSS 13.0數據處理軟件，各組數據結果以x±s表示，并進行單因素方差分析，LSD兩兩比較，P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 動態超高壓微射流預處理壓力對香菇多糖得率的影響

實驗組樣品在微射流均質機反應腔中受到強烈剪切、高速撞擊、壓力瞬時釋放、渦旋等綜合作用[6-7]，導致樣品顆粒在水中更均勻地分散、混合和微粒化；并使樣品細胞破碎度增大，溶劑利用細胞的通透性或滲透性，更易進入細胞內部，從而和細胞內的有效成分快速達到溶解平衡，更利于提取的進行[11]。不同預處理壓力(60～160MPa)對香菇多糖得率的影響如圖1所示。

圖1 動態超高壓微射流處理壓力對香菇多糖得率的影響Fig.1 Effect of microfluidization pressure on extraction rate of lentinan

由圖1可知，實驗組隨著預處理壓力的增大，香菇多糖得率呈現遞增趨勢。處理壓力從60MPa逐漸提高到160MPa，多糖得率由(5.65±0.17)%增高到(7.18± 0.15)%。當壓力增加到140MPa后，得率增幅較小，逐漸趨于平衡。單因素方差分析顯示在60、80、100、120、140MPa下，壓力對多糖得率具有顯著性影響(P＜0.01)。以上結果說明，均質壓力越高，可能細胞破碎程度越高，更利于多糖的溶出，得率有所提高。

2.2 動態超高壓微射流處理次數對香菇多糖得率的影響

M-110EH型微射流均質機最高操作壓力為172MPa，樣液最大流速為450mL/min，在此系統下，考察微射流處理次數對多糖得率的影響。

圖2 動態超高壓微射流處理次數對香菇多糖得率的影響Fig.2 Effect of microfluidization pretreatment repeat number on extraction rate of lentinan

如圖2所示，在1～5次不同處理次數下，經微射流處理2次，多糖得率最大，可達到(7.75±0.20)%；處理一次，樣液在反應腔中受力不充分，得率僅為(6.49±0.14)%；當處理次數超過2次后，樣液有一定程度的損失，從而造成多糖得率的下降，單因素方差分析表明處理次數對多糖得率具有顯著性影響(P＜0.01)。

2.3 實驗組與對照組不同提取時間多糖得率的比較

在傳統的溶劑提取過程中，時間對提取結果的影響較大，有效成分的溶出是一個平衡的過程，需要一定的時間。兩組實驗的比較結果如圖3所示。

圖3 兩組實驗不同時間段內的比較結果Fig.3 Comparison of extraction rates of lentinan in two groups with different pretreatment time

由圖3可見，實驗組在1～3h內，多糖得率基本沒有變化，僅從1h的(6.76±0.10)%增加到3h時的(7.02± 0.16)%，增幅較??；而對照組多糖得率隨時間的延長，有明顯提高。1h為(3.27±0.21)%，3h時為(5.56±0.21)%，增加了2.29%；且實驗組在1h時的得率就已高出對照組在3h時的得率1.2%。其原因在于，實驗組經微射流預處理后，細胞破碎程度大，再加上瞬時高壓的作用，溶劑能夠在極短的時間滲透到細胞內部，多糖溶解快速達到平衡，后續延長提取時間也不能明顯增加多糖得率。不同時間條件下，實驗組與對照組比較，有顯著差異(P＜0.05)。因此，微射流預處理樣液，省時高效，對提高香菇多糖得率效果顯著。

2.4 實驗組與對照組不同料液比多糖得率的比較

液體的體積，會影響固體微粒從固體主體向液體主體的傳質過程。但料液比過大，后續濃縮步驟耗能、耗時過多。兩組實驗的比較結果如圖4所示。

圖4 兩組實驗不同料液比的比較結果Fig.4 Comparison of extraction rates of lentinan in two groups with different material-liquid ratios

圖4 所示，實驗組多糖得率隨著料液比的增大，呈先增大后遞減趨勢，當料液比為1:60(g/mL)時達到最大得率(7.43±0.18)%。對照組得率先顯著增大后逐漸趨于平緩。料液比在1:40～1:50(g/mL)范圍內，得率增幅較大，平均得率增大1.3%。原因在于對照組多糖得率依靠液體體積效能明顯，在較低液體量時，提取不能充分進行。而實驗組，在引入微射流均質預處理的高撞擊、剪切、瞬時壓力降等作用后，增大了固液界面的湍流程度，同時瞬時壓力作用促進了傳質的過程，從而在較低液體量時，也能提取相對充分。實驗組得率有所降低，是因為液體量過大時，實驗組樣品顆粒相對更分散，在反應腔內，劇烈作用力下，可能導致多糖降解，得率降低。兩組多糖得率差異有顯著性(P＜0.05)。

2.5 實驗組與對照組不同溫度多糖得率的比較

圖5 兩組實驗不同溫度下的比較結果Fig.5 Comparison of extraction rates of lentinan in two groups with different temperatures

如圖5所示，實驗組得率隨溫度的增高顯著提高。對照組增幅不大。兩組實驗趨勢相同。一般來說，溫度升高，多糖的溶解度會增大，浸提液黏度會減少，擴散系數會增大[16]，這就促使浸提效率的提高。兩組實驗在60℃時無顯著差異，其他溫度下，差異顯著(P＜0.05)。

2.6 動態超高壓微射流預處理提取香菇多糖條件優化

表2 正交試驗設計L9(34)結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments

表3 正交試驗方差分析表Table 3 ANOVA analysis of orthogonal experiments

由表2可知，各因素影響主次順序為微射流均質壓力＞料液比＞提取溫度，提取條件的最優組合為A2B2C3，即微射流均質壓力140MPa、料液比1:60(g/ mL)、提取溫度90℃，此條件下多糖得率可達6.755%。表3中的方差分析表示，微射流均質壓力和料液比對多糖得率影響顯著(P＜0.05)。

3 結 論

經動態超高壓微射流預處理后的樣品液，由于在反應腔內受到超高壓微射流作用時的瞬間剪切、高速撞擊、渦旋、瞬間壓力降等作用力，固相顆粒粒度減小，細胞壁破裂，傳質速度加快，在后續提取過程中，與未經此處理的樣品相比較，在相同的提取時間、提取溫度及料液比內，香菇多糖的提取效率均有增高；動態超高壓微射流預處理的最佳條件為壓力140MPa、料液比1:60(g/mL)、提取溫度90℃，此條件下多糖得率最高，平均可達到6.755%。該研究可為動態超高壓微射流在有效成分提取上的應用提供參考。

[1]KUPFAHL C, GEGINAT G, HOF H. Lentinan has a stimulatory effect on innate and adaptive immunity against murine Listeria monocytogenes infection[J]. International Immunopharmacology, 2006, 6(4): 686-696.

[2]CHIHARA G, HAMURO J, MAEDA Y Y, et al. Fractionation and Purification of the polysaccharides with marked antitumor activity, especially lentinan, from Lentinus edodes(Berk.) Sing, (an edible mushroom) [J]. Cancer research, 1970, 30: 2776-2781.

[3]ZHANG Yangyang, LI Sheng, WANG Xiaohua, et al. Advances in lentinan: isolation, structure, chain conformation and bioactivities[J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25(2): 196-206.

[4]涂宗財, 王輝, 劉光憲, 等. 動態超高壓微射流對卵清蛋白微觀結構的影響[J]. 光譜學與光譜分析, 2010(2): 495-498.

[5]涂宗財, 姜穎, 陳鋼, 等. 動態超高壓微射流對花生球蛋白結構和功能性質的影響[J]. 食品工業科技, 2009, 30(12): 73-75.

[6]LIU Wei, LIU Jianhua, XIE Mingyong, et al. Characterization and highpressure microfluidization-induced activation of polyphenoloxidase from Chinese pear (Pyrus pyrifolia Nakai)[J]. Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(12): 5376-5380.

[7]LIU Wei, LIU Jianhua, LIU Chengmei, et al. Activation and conformational changes of mushroom polyphenoloxidase by high pressure microfluidization treatment[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2009, 10: 142-147.

[8]TUNICK M H, Van HEKKEN D L, COOKE P H, et al. Effect of high pressure microfuidization on microstructure of mozzarella cheese[J]. Lebensm-Wiss u-Technol, 2000, 33(8): 538-544.

[9]LAGOUEYTE N, PAQUIN P. Effects of microfluidization on the functional properties of xanthan on the functional properties of xanthangum [J]. Food Hydrocolloids, 1998, 12: 365-371.

[10]DALGLEISH D G, TOSH S M, WEST S, et al. Beyond homogenization: the formation of very small emulsion droplets during the processing of milk by a microfluidizer[J]. Netherlands Milk and Dairy Journal, 1996, 50(2): 135-148.

[11]涂宗財, 王艷敏, 劉成梅, 等. 動態超高壓微射流技術在玉米花粉多糖提取中的應用[J]. 食品工業科技, 2010(6): 212-214.

[12]WANG Xiaohua, XU Xiaojuan, ZHANG Lina. Thermally induced conformation transition of triple-helical lentinan in NaCl aqueous solution [J]. J Phys Chem, 2008, 112: 10343-10351.

[13]YAP A T, NG M L M. An improved method for the isolation of lentinan from the edible and medicinal shiitake mushroom, Lentinus edodes (Berk.)Sing.(Agaricomycetideae)[J]. International Journal of Medicinal Mushrooms, 2001, 3: 6-19.

[14]STAUB A M. Removal of proteins: sevag method[J]. Methods in Carbohydrate Chemistry, 1965, 5: 5-6.

[15]張惟杰. 糖復合物生化研究技術[M]. 杭州: 浙江大學出版社, 1999.

[16]謝紅旗. 香菇多糖提取、純化、結構表征及生物活性的研究[D].長沙: 中南大學, 2007.

Effect of Dynamic High-pressure Microfluidization Pretreatment on the Yield of Lentinan

JIANG Ying，TU Zong-cai*，CHEN Yuan，WANG Qiang，LI Zhi，YIN Yue-bin
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In order to extend the application of dynamic high-pressure microfluidization technology, this technology was used to the pretreatment of mushroom fruit bodies. The optimal pretreatment conditions were explored by single-factor and orthogonal experiments through evaluating the yield of lentinan. Results indicated that the optimal pretreatment conditions were pretreatment pressure of 140 MPa and material-liquid ratio of 1/60. Under the optimal pretreatment conditions, the yield of polysaccharides was up to 6.755%. Compared with the control group, the extraction rate of polysaccharides was significantly improved.

dynamic high-pressure microfluidization；lentinan；pretreatment；extraction

TS201.1

A

1002-6630(2010)24-0062-04

2010-09-16

國家科技型中小企業技術創新基金項目(10C26213601888)

姜穎(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為天然產物提取分離。E-mail：maomao242424@126.com

*通信作者：涂宗財(1965—)，男，教授，博士，研究方向為食品資源開發與利用。E-mail：tuzc_mail@yahoo.com.cn