雞肉蛋白的酶解及其抗氧化活性研究

孫楊贏，潘道東,2,*，郭宇星

(1.南京師范大學金陵女子學院食品科學與營養系，江蘇 南京 210097；2.寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江 寧波 315211)

雞肉蛋白的酶解及其抗氧化活性研究

孫楊贏1，潘道東1,2,*，郭宇星1

(1.南京師范大學金陵女子學院食品科學與營養系，江蘇 南京 210097；2.寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江 寧波 315211)

運用響應面(RSM)分析法對酶解雞肉蛋白制備抗氧化肽的工藝進行優化。在單因素試驗的基礎上，以還原能力和超氧陰離子自由基清除率為指標，研究酶解時間、加酶量、溫度對木瓜蛋白酶酶解雞肉蛋白的酶解液抗氧化性的影響。結果表明，酶解雞肉蛋白制備抗氧化肽的工藝條件為pH6.0、液固比2:1(mL/g)、酶解時間6.15h、加酶量1200U/g、溫度51.2℃，此時還原能力達到0.802，超氧陰離子自由基清除率達到73.9%。

雞肉蛋白；酶解；抗氧化活性；響應面分析

我國是雞肉生產大國，然而我國的雞肉產品結構不合理。因此，在發展雞肉制品方面，有必要注重提高產品的方便性、高科技性、營養性[1]。蛋白質酶解有助于改善其營養價值和功能特性，有研究表明雞肉蛋白水解物具有一定程度的抗氧化性[2]，這說明雞肉蛋白中蘊含著具有抗氧化活性的肽序列，選擇適當的蛋白酶體外酶解雞肉蛋白有利釋放出有活性的肽段。氧化與人類的許多疾病諸如癌癥、老化、動脈硬化等的發病機理有關。適當攝入具有抗氧化活性的物質可以降低體內自由基水平，防止脂質過氧化，幫助機體抵御疾病。近年來，關于蛋白水解物抗氧化性的研究已有許多報道，如白蝦頭蛋白[3]、牛蛙皮蛋白[4]、草魚蛋白[5]、豬皮膠原蛋白[6]、魚鱗蛋白[7]、雞蛋蛋清[8]等，但對雞肉蛋白酶解產物的研究相對較少。

本研究采用木瓜蛋白酶水解雞肉蛋白，在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析法對水解工藝條件進行優化并研究酶解產物的抗氧化活性，旨在為酶解制備有關生物活性肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞脯肉(冷藏) 市購；中性蛋白酶(5萬U/g)、木瓜蛋白酶(80萬U/g) 南京奧多福尼生物科技有限公司；其他試劑 上海久億化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠制造；HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；PHS-3L型精密pH計 上海今邁儀器儀表有限公司；LDS5-1離心機北京醫用離心機廠；722型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雞肉蛋白水解產物的制備工藝

雞脯肉→清洗絞碎→按比例加水勻漿→調節pH值→加酶保溫酶解→滅酶(100℃，15min)→離心(4000r/ min，20min)→上清液過濾→雞肉蛋白酶解液

1.3.2 總氮的測定

采用凱氏定氮法[9]。

1.3.3 水解度的測定

采用茚三酮比色法[10]。

1.3.4 肽含量的測定

采用TCA法結合雙縮脲法[11]。

1.3.5 還原能力的測定

采用Wu等[12]的方法，并略做修改。取0.1mL樣品溶液，加入2mL 0.2mol/L的磷酸緩沖液(pH6.6)，2mL 1g/100mL鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶液，混勻后于50℃水浴下保溫20min，再加入2mL 10g/100mL的三氯乙酸(TCA)溶液，混勻后于3000r/min離心10min。取離心后的上清液2mL，加入2mL去離子水和0.4mL 0.1g/100mL的FeCl3溶液，混勻后于50℃水浴下保溫10min，于700nm波長處測定其吸光度，樣品吸光度越大則其還原能力越大。以去離子水代替樣品作為空白對照。

1.3.6 超氧陰離子自由基清除率的測定

采用李艷紅等[13]的方法，并略做修改。取0.1mL樣品溶液，加入2.8mL 0.1mol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH8.2)，空白對照管以雙蒸餾水代替樣品，混勻后于25℃水浴下保溫10min，加入0.1mL 3mmol/L的鄰苯三酚溶液(25℃水浴預熱)，迅速混勻并開始計時，每隔30s于325nm波長處測定吸光度，5min后結束，以0.1mL雙蒸水加2.8mL Tris-HCl緩沖溶液調零。作吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率V，按下式計算樣品對超氧陰離子的清除率：

清除率/%=(V對照-V樣品)/V對照×100

式中：V對照為對照組鄰苯三酚自氧化速率/(ΔV對照/ min)；V樣品為樣品組鄰苯三酚自氧化速率/(ΔV樣品/min)。

1.3.7 酶種類的確定

參考有關資料[7,14-16]，選取了中性蛋白酶及木瓜蛋白酶兩種酶，分別對雞肉蛋白進行水解2、4、6、8、10h。液固比2:1(mL/g)，酶用量1000U/g原料、自然pH(6.0)、溫度50℃的條件下進行水解，并分別測定雞肉蛋白酶解液的水解度、肽含量、還原能力和超氧陰離子自由基清除率。

1.3.8 水解條件的確定

首先通過單因素試驗，考察水解時間、液固比、加酶量、pH值、水解溫度對蛋白酶水解效果的影響，以還原能力和超氧陰離子自由基清除率為評價指標。

然后根據單因素試驗結果，采用響應面設計試驗，運用Box-Behnken的中心組合試驗設計原理。以水解時間(X1)、加酶量(X2)、水解溫度(X3)為變量，開展三因素三水平的響應面試驗，試驗設計見表1。采用F檢驗對實驗數據進行方差分析以評價模型的統計意義。數據分析軟件采用Design-Expert 7.1.3。

表1 Box-Behnken試驗設計Table 1 Design of Box-Behnken response surface experiments

2 結果與分析

2.1 最佳酶種類的確定

酶種類是酶解過程中最重要影響因素之一。結果表明，采用木瓜蛋白酶水解雞肉蛋白得到的酶解液的還原能力高達0.874，超氧陰離子自由基清除率高達82.98%，此時對應的水解度和多肽含量分別為25.28%和32.05mg/mL。而經中性蛋白酶水解雞肉蛋白得到的酶解液的還原能力最大只有0.618，超氧陰離子自由基清除率高達44.55%，此時對應的水解度和多肽含量分別為27.43%和31.41mg/mL。可以發現，兩種酶對水解度和多肽含量的影響相似，而對酶解液的抗氧化活性的影響相差較大。經上述兩種酶分別酶解雞肉蛋白所得到的酶解液的抗氧化活性不同，是由于酶解產物中短肽的組成及結構不同。木瓜蛋白酶水解過程中作用位點比中性蛋白酶廣泛，得到分子質量較小的多肽，使更多的活性位點暴露出來，從而抗氧化能力增強。木瓜蛋白酶對雞肉蛋白的水解效果遠遠好于中性蛋白酶水解的效果，故選用木瓜蛋白酶進行以下的實驗。

2.2 單因素試驗分析

2.2.1 水解時間對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響

在液固比2:1(mL/g)、加酶量1000U/g、溫度50℃的條件下考察水解時間對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響。從圖1可以看出，前6h還原能力隨著時間的延長上升很快，在第6小時達到最大值0.874。6h之后還原能力有下降的趨勢。另外超氧陰離子清除率也在第6小時達到最大，其最大值82.97%，6h后緩慢下降。因此酶解時間以6h為宜。此時對應的水解度和多肽含量分別為25.28%和32.05mg/mL。

圖1 時間對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on reducing power and scavenging rate on superoxide anion free radicals

2.2.2 液固比對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響

圖2 液固比對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on reducing power and scavenging rate on superoxide anion free radicals

在加酶量1000U/g、時間6h、溫度50℃的條件下考察液固比對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響。結果如圖2所示，液固比為2:1(mL/g)時，還原能力和超氧陰離子自由基清除率均達到最大，分別為0.823和77.81%。在液固比小于2:1(mL/g)時，隨著液固比的增加，即隨著底物濃度的減少，還原能力和超氧陰離子自由基清除率增加，液固比大于2:1(mL/g)時，還原能力和超氧陰離子自由基清除率下降。這是由于底物濃度的減少，底物可以更好地與酶接觸，加速了酶解反應。同時酶的用量是以底物來計算的，液固比增加的同時，酶的濃度也有所減少。因此最佳液固比為2:1(mL/g)。此時對應的水解度和多肽含量分別為21.26%和36.54mg/mL。

2.2.3 加酶量對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響

圖3 加酶量對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition amount on reducing power and scavenging rate on superoxide anion free radicals

在液固比2:1(mL/g)，時間6h，溫度50℃的條件下考察加酶量對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響。結果如圖3所示，加酶量為1000U/g時，還原能力和超氧陰離子自由基清除率均達到最大，分別為0.818和88.19%。因此最佳加酶量為1000U/g。此時對應的水解度和多肽含量分別為26.74%和29.81mg/mL。

2.2.4 pH值對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響

圖4 pH值對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.4 Effect of pH value on reducing power and scavenging rate on superoxide anion free radicals

在液固比2:1(mL/g)、時間6h、溫度50℃的條件下考察pH值對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響。圖4表明，在自然pH6.0之前提高pH值，還原能力和超氧陰離子自由基清除率都會增加，而在pH6.0之后提高pH值，還原能力和超氧陰離子自由基清除率都會減小。因此酶解在自然pH值下進行。此時的還原能力、超氧陰離子自由基清除率、水解度和多肽含量分別為0.811、67.00%、23.26%和28.85mg/mL。

2.2.5 水解溫度對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響

在液固比2:1(mL/g)、時間6h、加酶量1000U/g的條件下考察溫度對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響。結果如圖3所示，在50℃之前提高溫度，還原能力和超氧陰離子自由基清除率逐漸增加，在50℃之后提高溫度，由于溫度升高而使酶的活性降低，反應速率下降，還原能力和超氧陰離子自由基清除率也逐漸降低。還原能力和超氧陰離子自由基清除率隨著溫度的上升緩慢增加，在50℃時達到最大值，分別為0.732和73.21%。但隨著溫度的進一步升高，還原能力和超氧陰離子自由基清除率都有所降低，因此最佳溫度為50℃。此時對應的水解度和多肽含量分別為26.55%和28.81mg/mL。

圖5 溫度對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on reducing power and scavenging rate on superoxide anion free radicals

2.3 響應面試驗分析

表2 Box-Behnken試驗設計及其試驗結果Table 2 Design and results of Box-Behnken response surface experiments

由單因素試驗可知，不同的液固比影響酶解液的抗氧化活性，為測定抗氧化活性，必須將酶解液量濃縮到同一條件下，但濃縮時耗能過大，所以選擇液固比2:1(mL/g)為最適加水量。在一定pH值下酶表現最大活力，過高過低的pH值會改變酶的活性中心構像，或甚至改變整個酶分子的結構使其變性失活，同時，考慮到pH6.0為雞肉蛋白酶解液的自然pH值，為防止pH值影響雞肉蛋白的結構，獲得最大的雞肉蛋白酶解液的抗氧化活性，所以選擇自然pH6.0為最適pH值。因此，選用水解時間(X1)、加酶量(X2)、水解溫度(X3)為變量，開展三因素三水平的響應面試驗。

木瓜蛋白酶水解雞肉蛋白的響應面分析試驗根據Box-Behnken設計進行了17組試驗，其中5組中心點重復試驗，結果見表2。利用Design Expert 7.1.3軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，得到還原能力Y1和超氧陰離子清除率Y2的標準回歸方程，其整體模型的P值都小于0.05，表明該二次方程模型顯著。并且由表3和表4可以看出，R2Adj分別為0.9266和0.9533。失擬項分別為0.1374和0.1906，均不顯著，說明該模型擬合程度良好，用該模型對木瓜蛋白酶水解雞肉蛋白的水解過程進行優化是合適的。

表3 還原能力的二次多項模型方差分析表Table 3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model of reducing power

表4 超氧陰離子自由基清除率的二次多項模型方差分析表Table 4 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model of scavenging rate on superoxide anion free radicals

表5 還原能力的回歸方程系數顯著性檢驗Table 5 Significance test of regression coefficients for the fitted quadratic polynomial model of reducing power

表6 超氧陰離子自由基清除率的回歸方程系數顯著性檢驗Table 6 Significance test of regression coefficients for the fitted quadratic polynomial model of scavenging rate on superoxide anion free radicals

圖6 不同變量對還原能力的響應面Fig.6 Response surface plots for the effects of different factors on reducing power

圖7 不同變量對超氧陰離子自由基清除率的響應面Fig.7 Response surface plots for the effects of different factors on scavenging rate on superoxide anion free radicals

從表5可以看出，溫度對于還原能力的影響最為顯著。從表6可以看出，加酶量對于超氧陰離子自由基清除率的影響最為顯著。從表5和表6回歸系數顯著性檢驗表明，方程一次項和二次項對還原能力和超氧陰離子自由基清除率的影響是顯著的，交互項影響相對不顯著，說明響應值的變化較為復雜。

因此，去除影響不夠顯著的項，對試驗初步所得的回歸方程進行修正。修正后的方程為：

Y1=0.77+0.025X1+0.040X2+0.044X3-0.019X2X3-0.033X12-0.018X22-0.028X32

Y2=70.89+2.39X1+2.97X2-2.10X1X2-6.02X12-1.5X32

根據回歸方程可以繪出響應面分析圖，如圖6、7所示。通過該組圖即可對任何兩因素交互影響還原能力和超氧陰離子自由基清除率效應進行分析與評價，并從中確定最佳因素水平范圍。結果表明，加酶量和溫度交互作用對還原能力影響顯著，時間和加酶量對超氧陰離子自由基清除率影響顯著，其他各個因素的交互作用不是很顯著。

2.4 驗證實驗

根據Box-Behnken試驗所得的結果和二次多項回歸方程，利用Design Expert7.1.3軟件獲得了抗氧化活性最高時的各個因素的最佳酶解工藝條件，即pH6.0、液固比2:1(mL/g)、時間6.15h、加酶量1200U/g、溫度51.2℃，進行驗證實驗，此時雞肉蛋白酶解液還原能力達到0.802，超氧陰離子自由基清除率達到73.9%，這與理論預測值0.795和73.5%誤差均在±1%以內，說明采用RSM優化得到的酶解工藝條件參數準確可靠，按照建立的模型進行預測在實踐中是可行的。

3 結 論

通過單因素分析和響應面試驗設計，確定各因素對雞肉蛋白酶解液的還原能力的影響順序為溫度＞加酶量＞時間；各因素對雞肉蛋白酶解液的超氧陰離子自由基清除率的影響順序為加酶量＞時間＞溫度。最后利用響應面分析優化雞肉蛋白制備抗氧化肽得到的工藝條件為pH6.0、液固比2:1(mL/g)、時間6.15h、加酶量1200U/g、溫度51.2℃。該條件下制備的雞肉蛋白酶解液的還原能力和超氧陰離子自由基清除率分別為0.802和73.9%，與理論預測的相對誤差在±1%以內，說明利用本實驗建立的模型的優化結果與實際情況吻合。

[1]廖洪波, 馬海霞, 尚勇彪, 等. 大力發展雞肉制品工業[J]. 肉類工業, 2003(12): 44-47.

[2]趙謀明, 周雪松, 林偉鋒. Alcalase降解水不溶性雞肉蛋白規律及其產物清除DPPH活性研究[J]. 食品工業科技, 2005, 26(11): 59-61.

[3]BINSAN W, BENJKUL S, VISESSANGUAN W, et al. Antioxidative activity of Mungoong, an extract paste, from the cephalothorax of white shrimp (Litopenaeus vannamei)[J]. Food Chemistry, 2008, 106(1): 185-193.

[4]QIAN Z J, JUNG W K, KIM S K. Free radical scavenging activity of a novel antioxidative peptide purified from hydrolysate of bullfrog skin, Rana catesbeiana Shaw[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(6): 1690-1698.

[5]REN Jiaoyan, ZHAO Mouming, SHI J, et al. Purification and identification of antioxidant peptides from grass carp muscle hydrolysates by consecutive chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2008, 108(2): 727-736.

[6]LI Bo, CHEN Feng, WANG Xi, et al. Isolation and identification of antioxidative peptides from porcine collagen hydrolysate by consecutive chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2007, 102: 1135-1143.

[7]涂宗財, 鄭明, 陳鋼, 等. 酶解魚鱗蛋白制備抗氧化肽的研究[J]. 現代食品科技, 2009, 30((7): 202-203; 206.

[8]金嫘, 王晶, 李新華. Alcalase堿性蛋白酶酶解蛋清制備抗氧化活性肽[J]. 食品研究與開發, 2009, 30(6): 59-62.

[9]大連輕工業學院, 華南理工大學, 華南理工學院, 等. 食品分析[M].北京: 中國輕工業出版社, 2004: 156-160.

[10]趙新淮, 馮至彪. 大豆蛋白水解物水解度測定的研究[J]. 東北農業大學學報, 1995, 26(2): 178-181.

[11]魯偉, 任國譜, 宋俊梅. 蛋白水解液中多肽含量的測定方法[J]. 食品科學, 2005, 26(7): 169-171.

[12]WU Huichun, CHEN Huaming, SHIAU Chyuanyuan. Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus)[J]. Food Reseach International, 2003, 36(9/10): 949-957.

[13]李艷紅, 劉堅, 張濤, 等. 酶解鷹嘴豆蛋白制備抗氧化肽工藝優化研究[J]. 農業工程學報, 2008, 24(1): 268-273.

[14]付剛, 李誠, 馬長中, 等. 豬骨抗氧化肽的酶解制備研究[J]. 現代食品科技, 2006, 22(3): 136-138.

[15]邱春江, 陳慧. 木瓜蛋白酶水解文蛤蛋白制備小分子肽及其抗氧化研究[J]. 食品科技, 2008(3): 180-182.

[16]閻欲曉, 粟桂嬌. 文蛤肉酶解液清除自由基能力的研究[J]. 食品工業科技, 2004, 25(10): 60-62.

Enzymatic Hydrolysis of Chicken Protein and Antioxidant Activity of Antioxidant Peptide

SUN Yang-ying1，PAN Dao-dong1,2,*，GUO Yu-xing1
(1. Department of Food Science and Nutrition, Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. College of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The enzymatic hydrolysis parameters for preparing antioxidant peptide from chicken protein were optimized by response surface analysis. Based on the results of single factor experiments, the effects of hydrolysis time, enzyme addition amount, hydrolysis temperature on the hydrolysis degree of chicken protein and antioxidant capability of antioxidant peptide were explored through evaluating the reducing power and scavenging rate on superoxide anion free radicals. Results indicated that the optimal preparation processing conditions of antioxidant peptides from chicken protein by papain hydrolysis were pH 6.0, materialwater ratio of 1:2, hydrolysis time of 6.15 h, papain amount of 1200 U/g and hydrolysis temperature of 51.2 ℃. Under the optimal hydrolysis conditions, reducing power and scavenging rate of antioxidant peptide were 0.802 and 73.9%, respectively.

chicken protein；hydrolysis；antioxidant activity；response surface methodology

TQ936.16

A

1002-6630(2010)24-0056-06

2010-03-06

江蘇省科技支撐計劃項目(BE2009366)；國家農業科技成果轉化基金項目(2009GB2C220412)

孫楊贏(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為農產品加工。E-mail：syy8611@yahoo.com.cn

*通信作者：潘道東(1964—)，男，教授，博士，研究方向為畜產品加工。E-mail：daodongpan@163.com