纖維素酶酶解醇葛根素研究

王星敏，殷鐘意，李 鑫，張渝文

(1.重慶工商大學環境與生物工程學院，重慶 400067；2.重慶大學資源及環境科學學院，重慶 400033；3.重慶工商大學 廢油資源化技術與裝備教育部工程中心，重慶 400067)

纖維素酶酶解醇葛根素研究

王星敏1,2,3，殷鐘意1,3，李 鑫1，張渝文1

(1.重慶工商大學環境與生物工程學院，重慶 400067；2.重慶大學資源及環境科學學院，重慶 400033；3.重慶工商大學 廢油資源化技術與裝備教育部工程中心，重慶 400067)

以提取葛粉后的葛根廢渣為研究對象，采用微生物和代謝物酶解提制葛根素，通過高效液相色譜法分析葛根素含量，考察影響葛根素溶出的酶解時間、酶量、pH值、固液比等參數，探索微生物與底物葛渣間的生物交互作用。實驗結果表明：葛根廢渣5g，纖維素酶量為底物40%，葛根廢渣與水的質量比為1:10，pH值為5，在30℃酶解36h后，經乙醇浸提3h，可提取葛根素33.54mg，為葛根廢渣的資源化再利用提供實驗基礎。

纖維素酶；葛根素；葛根廢渣；酶解；交互作用

生物交互作用[1]指一因子因另一因子的不同水準具有不同的效果。鮮葛根主要以有異黃酮類化合物(約1.3%)、淀粉(約40.0%)和膳食纖維(40.0%)為主，作為醫藥和保健食品的原料或添加劑[2]的葛根素多附著在纖維等植物組織壁上。隨著葛根素在醫藥和保健行業[3]的深入開發和廣泛食用，異黃酮類化合物的提取越來越其引起科研者和開發商的關注；而纖維素酶具有降解植物纖維原料的作用，常被應用于天然產物的提取[4]或功能食品的開發[5]，逐漸有代替提取葛根素的四大傳統工藝[6]之勢。但在微生物酶解提制葛根素的體系中，微生物及依存空間均以開放形式存在于化學因子和物理因子的環境因素中，微生物菌種不可避免地與各因素發生交互作用；影響纖維素酶產量和活力的因素除菌種外，還有pH值、培養溫度、水分、基質等；這些因素不是孤立存在的，而是相互聯系的。為實現葛渣資源綜合利用，本實驗以提取葛粉后的葛根廢渣為研究對象，采用生物酶解法降解葛渣植物組織，減少葛根素提取傳質阻力[4]，通過測定葛根素含量，探索酶與植物組織間生物交互作用的影響因素，為葛產業集約化發展而囤積的葛根廢渣消減及資源綜合利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根廢渣(提取葛根淀粉)取自重慶北碚農戶。

葛根素(標品)、乙醇(分析純)、硫酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)和甲醇(分析純)。

1.2 儀器與設備

GOLD 166P高效液相色譜儀 美國System公司；DELTA 320-5 pH計 梅普勒-托利多儀器廠；RE-2000旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-B往返水浴恒溫振蕩器 上海躍進醫療器械廠；FA2004電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養方法

選用白腐真菌等微生物，分別經過斜面培養、種子液體培養后，按一定比例接種入搖瓶培養；接入量為5%，29℃、180r/min條件下，混合培養48h。

1.3.2 酶解提制方法

稱取粉碎后20目的葛根廢渣5.00g至0.25L干凈的錐形瓶中，設定固液比、溫度、pH值，按比例接入培養好的菌種接種液或纖維素酶，發酵處理一定時間后，過濾，測定酶解液中的葛根素含量；根據葛根素溶于水中微溶的性質，用乙醇浸提濾渣，測定醇提液中的葛根素含量，二者之和為葛渣中葛根素的含量；合并測定液，經大孔樹脂富集、純化，蒸餾后得產品。

1.3.3 提取工藝參數

葛根廢渣與水質量比為1:10，微生物(纖維素)接種量5%～40%，酶解溫度20～40℃，pH4～8，在水浴恒溫振蕩器中連續酶解36h，進間歇通過無菌空氣(平均10min/h)；乙醇與葛渣固液比為1:15，醇提時間3h。1.3.4分析方法

采用色譜分析方法[8-9]測定葛根素標品。繪制葛根素標準曲線，可得到葛根素質量濃度(x，g/L)與峰面積(y)的關系方程：y=35415x-14502，R2=0.9993；色譜條件為：色譜柱：C18；柱溫：30℃；流動相：甲醇-水(25:75)；檢測波長：250nm；流速：1.0mL/min；進樣體積：10μL。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶酶解活力比較

2.1.1 酶解法與常規化學醇提法的比較

圖1 生物酶解法與常規醇提法的比較Fig.1 Comparison of extraction method with biological enzymes and conventional ethanol extraction

纖維素酶是一種復合酶，主要包含外切β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等[10]，還有很高活力的木聚糖酶活力，易催化水解破壞葛根細胞壁的纖維結構。對比酶解生物效應和化學醇提效應，選用相同量乙醇分別浸提相同質量的葛根廢渣。由圖1可知，在任一時間，經酶解后的葛根素溶出量均高于常規化學醇提法，且經4h后常規醇提法提取葛根素變化趨于平緩約11.05mg；而酶解法在36h有最大值為24.71mg，明顯高于常規化學醇提法。

2.1.2 微生物與纖維素酶酶解作用對比

纖維素酶只是微生物代謝酶的一種，為比較微生物和代謝物酶之間的酶解優勢，在相同條件下，選擇管囊酵母、白腐真菌和纖維素酶處理相同質量的原料，由圖2可知，纖維素酶解出葛根素含量高于管囊酵母和白腐真菌，表現較強的酶解性能，且在36h時，獲得葛根素量為23.42mg。原因在于：在酶解初期，微生物能代謝出不同酶，催化降解植物組織能力較強，釋放葛根素量較強，但隨著時間的進行，微生物菌種易退化而降低產酶力[11]，降低降解植物組織能力，葛根素的有效釋放能力明顯低于纖維素酶。

圖2 微生物與纖維素酶的酶解作用對比Fig.2 Comparison on enzymatic hydrolysis effect of cellulose and microorganisms

2.2 不同纖維素酶量對葛根素含量的影響

設定加酶量(纖維素酶投入量與底物質量)比為5%、10%、20%、30%、40%。由圖3可知，投入量為40%時，葛根素的含量最高，質量濃度為0.485mg/mL，含量為24.24mg。原因在于：纖維素酶在分解纖維素時起生物催化作用[12-13]，投入量適中有助于催化葛根植物組織降解，葛根素得以充分釋放。

圖3 不同加酶量對葛根素含量的影響Fig.3 Effect of cellulose content on extraction rate of puerarin

2.3 酶解環境因素對葛根素浸出的影響

2.3.1 不同固液比對葛根素含量的影響

對比圖4酶提液和醇提液中葛根素含量可知，纖維素酶解活力受酶解體系固液比的影響，相同量的葛根廢渣釋放出不同量的葛根素；當酶解固液比為1:10，葛根素酶解量明顯高于醇提量，溶出量高達17.837mg，葛根素總量為28.590mg。這是由于當培養基含水量過低，物料疏松，纖維素酶無法完全吸附底物，酶活力不夠，降解能力變低；培養基含水量過大，物料過于黏稠，供氧及散熱條件惡化，酶催化效率降低，導致葛根素得率也隨之降低。

圖4 固液比對葛根素含量的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of puerarin

2.3.2 不同pH值對葛根素含量的影響

圖5 不同pH值對葛根素含量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH value on extraction rate of puerarin

大多數酶作用于底物有最適pH值[14]，一般為4.0～6.0。從圖5可以看出，纖維素酶在酸性條件影響較小，且在pH5時，纖維素酶表現出最適應，其葛根素質量濃度分別為0.397mg/mL和0.347mg/mL；但在pH8時，纖維素酶的催化水解能力明顯下降，葛根素得率最低。

2.3.3 不同酶解溫度對葛根素含量的影響

酶類屬于蛋白質類物質[15]，大多數纖維素酶都具有較高穩定性；但對溫度較敏感，而適宜溫度一般可增大酶活性，促進植物纖維的降解。由圖6可以看出，發酵溫度的變化對酶解獲取葛根素影響較大，當溫度為30℃時，酶解活力充分，葛根素提取量達到最高為14.719mg。

圖6 不同酶解溫度對葛根素含量的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of puerarin

2.4 葛根素液相成分分析

圖7 葛根素樣品與標準品液相色譜圖對比Fig.7 Comparison on liquid chromatographs of samples and standard product

通過以上纖維素酶作用及單因素試驗，確立了酶解提制葛根素的交互作用效應的影響因素及最佳條件。將5g葛根廢渣在各個最佳條件下酶解36h后，經一定量乙醇浸提3h，能提取葛根素33.54mg，高于單因素試驗值，是常規化學醇提法(11.05mg)的3倍。由圖7可知，樣品中酶解所得產物均為葛根素。

3 結 論

3.1 生物酶解法優于常規化學醇提法，且纖維素酶的酶解效果優于微生物。

3.2 影響生物酶解提制葛根素的交互作用效應的因素為：投入底物質量的40%的纖維素酶，設置固液比為1:10，pH5，在30℃酶解36h，經一定量的乙醇醇提3h，5g葛根廢渣能獲得葛根素33.54mg，是常規化學醇提法的3倍。

[1]秦文弟. 復合污染對土壤生物的交互作用[J]. 河南科學, 2008, 26(6): 730-733.

[2]張雁, 池建偉, 張名位, 等. 新鮮葛根中總黃酮和淀粉的提取工藝研究[J]. 中國食品學報, 2008(3): 73-77.

[3]李悅, 李艷菊. 國內外葛根功能食品研究進展[J]. 食品研究與開發, 2007(12): 174-177.

[4]施英英, 薛培儉, 夏黎明. 酶法提取葛根渣中異黃酮的研究[J]. 林產化學與工業, 2006, 26(3): 62-64.

[5]李積華, 劉成梅, 李明. 功能性葛根天然飲料工藝研究[J].江西食品工業, 2004(1): 20-22.

[6]趙浩如, 郜鳳香. 葛根總黃酮的提取方法研究[J].中成藥, 2000, 22 (11): 756-757.

[7]KRIAKOSYAN A, KAUFMAN P B, WARBER S, et a1．Quantification of major isoflavones and L-canavanine in several organs of kudzu vine(Pueraria montana)and in starch samples derived from kudzu roots [J]. Plant Science, 2003, 164: 883-888.

[8]PRASAIN J K, KENNETH J, MARION K, et a1. Profiling and quantification of isoflavones in kudzu dietary supplements by hish: performance liquid chromatography and eleetmspmy ionization tandem mgss spectrometry[J]. Agricultral and Food Chemistry, 2003, 51: 4213-4218.

[9]劉逢芹, 劉田云, 李貴海, 等. 分光光度法和HPLC法測定野葛藤總黃酮及葛根素含量[J]. 中藥材, 2005(10): 895-896.

[10]邵學良,劉志偉. 纖維素酶的性質及其在食品工業中的應用[J]. 中國食物與營養, 2009(8): 34-36.

[11]RABINOVICH M L, MELINK M S, BOLOBOVA A V. Cellulases from microorganisms[J].Prikl Biokhim Microbiol, 2002, 38(4): 355-373.

[12]KAZUHIRO H, MAKOTO M, KAORU N, et al. Phenolic glucosides from the root of Pueraria lobata[J]. Phytocchemistry, 1997, 46(5): 921-928.

[13]DAS S. Enzyme application in textiles[J]. The Indian Textile Journal, 2000, 29: 27-31.

[14]曾青蘭. 纖維素酶及其應用[J]. 河北農業科學, 2008(8): 171-172.

[15]張曉勇, 陳秀霞. 纖維素酶的蛋白質工程. 纖維素科學與技術, 2006, 14(2): 56-58.

Ethanol Extraction of Puerarin by Cellulase Hydrolysis

WANG Xing-min1,2,3，YIN Zhong-yi1,3，LI Xin1，ZHANG Yu-wen1
(1. School of Environmental and Biological Engineering, Chongqing Technology and Business University, Chongqing 400067, China；2. School of Resources and Environmental Science; Chongqing University, Chongqing 400033, China；3. Engineering Research Centre for Waste Oil Recovery Technology and Equipment, Ministry of Education, Chongqing Technology and Business University, Chongqing 400067, China)

Puerarin was extracted by enzymatic hydrolysis with microbe and cellulase from waste pueraria. High performance liquid chromatography was used to determine puerarin content for exploring the effects of enzymatic hydrolysis time, enzyme addition amount, pH and material-liquid ratio as well as cross-interaction on extraction rate of puerarin. Results indicated that pueraria amount of 5 g, cellulose concentration of 40% compared with pueraria weight, pueraria-water ratio of 1:10, enzymatic hydrolysis pH of 5, enzymatic hydrolysis temperature of 30 ℃, enzymatic hydrolysis time of 36 h and ethanol extraction time of 3 h. Under the optimal enzymatic hydrolysis and extraction conditions, the yield of puerarin was up to 33.54 mg. These investigations will provide a theoretical reference for the exploration and utilization of pueraria.

cellulase；puerarin；pueraria waste；enzymolysis；biological interaction

TQ 028.8

A

1002-6630(2010)24-0046-04

2010-09-21

重慶市科技攻關項目(cstc，2010AC1061)；重慶市教委科技項目(cqjwKJ100708)

王星敏(1975—)，女，副教授，博士研究生，主要從事固體廢棄物資源化開發與資源化利用研究。E-mail：wxm0826@ctbu.edu.cn