松油烯-4-醇對結直腸癌細胞惡性行為的影響及其機制

楊 艷 ，吳映敏， 曾智銳，李 連，張 毅，陳騰祥

(1.貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學教研室，貴州 貴陽 550004; 2. 貴州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院輸血科，貴州 都勻 558000；3. 貴州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，貴州 貴陽 550004)

在我國，結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種發(fā)病率及惡性程度極高的惡性腫瘤。根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的最新全球癌癥數(shù)據(jù)，2020年結直腸癌的發(fā)病率約為24.8/10萬、死亡率約為12.0/ 10萬[1]。在中國，結直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，死亡率亦明顯增加[2]。臨床治療結直腸癌的方法以手術治療為主，而化療為中晚期結直腸癌術后的最常用輔助治療方法，常用的一線化療藥物有5-氟尿嘧啶(5-FU)和鉑類[3]。然而，多數(shù)患者不良反應較重，且化療后易復發(fā)[4]。因此，需要不斷地篩選功能化合物分子作為新藥前體供開發(fā)利用。

精油主要來源于植物且具有抗癌作用[5]。精油的主要有效成分之一為松油烯-4-醇 ( terpinen-4-ol，化學式: C10H18O，T4O)，其安全性高，已被FDA批準作為上市的治療皮膚真菌病的藥物[6]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)T4O具有誘導神經(jīng)膠質瘤細胞凋亡及周期阻滯的作用[7]。因此，其在腫瘤中的應用被廣泛關注。本研究擬探討T4O對RKO與HCT116細胞惡性生物學行為的影響及作用機制，以期為T4O在結直腸癌的治療中提供有力依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細胞 結直腸癌細胞RKO和HCT116購于美國The Global Bioresource Center細胞庫，保存于本室。

1.1.2試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號：31800-022)、DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號：SH30022.01)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，貨號：AB20180213E)均購于上海諾娃醫(yī)藥科技有限公司；CCK-8試劑盒(貨號：C0037)購自上海瑤韻生物公司；凋亡檢測試劑盒(貨號：KGF004)購自杭州昊鑫生物科技有限公司；周期檢測試劑盒(貨號：22845)購自西安百螢生物科技有限公司；Transwell小室(貨號：3413)和基底凝膠(貨號：356231)購于上海凌儀生物科技有限公司；RIPA 裂解液(貨號：abs9116)和PMSF(貨號：0754-5G)購于索萊寶生物公司；SDS-PAGE制膠試劑盒(貨號：KGP113-8%)購于江蘇慧智生物科技有限公司；兔源性α-tublin單克隆抗體(ER130905)和兔源性Caspase 7多克隆抗體(3010-100)購于上海齊源生物科技有限公司；兔源性NR3C1單克隆抗體(A-AO1504a)、兔源性P21多克隆抗體(LS-C54485)、兔源性E-cadherin多克隆抗體(ABP51220)和山羊抗兔(111-005-003)二抗購于武漢艾美捷科技生物公司；兔源性N-cadherin多克隆抗體(GTX50758)購于上海長島生物技術公司；兔源性Cyclin B1多克隆抗體(M1508-1)購于華安生物；兔源性cleaved-Caspase7多克隆抗體(WL02360)購于沈陽萬類生物科技有限公司；T4O(純度>99.5%;3001)購于合肥天健化工公司；陽性藥物5-Fu(純度> 99.67%;HY-90006)和放線菌酮(CHX; 純度>99.86%，HY-12320)購于武漢MCE生物公司。藥物均以二甲基亞砜配制成10 mmol·L-1的母液放于-20 ℃冰箱中。轉染脂質體3000(L3000150)購自美國賽默飛生物公司；靶向NR3C1的小干擾RNA (si-NR3C1)和陰性對照小干擾RNA(NC)均購自于北京易錦生物，si-NR3C1和NC序列分別為5′-ACTGGCTGTCGCTTCCTCAAT-3和5′-AACACCGAACGAGUCACGATT-3′。

1.1.3儀器 酶標儀(型號：RT-6000)購于上海天呈科技有限公司重慶辦事處；培養(yǎng)箱(型號：BPH-962)購于江蘇迅迪儀器科技有限公司；流式細胞儀(型號：ACEA NovoCyte)購于福州科遠貿(mào)易有限公司；超凈臺(型號：BBS-SDC)購于濟南泰醫(yī)生物技術有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號：1025025 Rev A)購于美國Bio-rad公司；倒置顯微鏡(型號：XD-202)購于巴玖實業(yè)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) RKO用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)，HCT116用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)。兩種細胞均放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)，隔日換液。根據(jù)細胞生長狀態(tài)，待密度匯達80%以上，消化后傳代并凍存。

1.2.2運用CCK-8實驗檢測T4O對細胞增殖的影響 結直腸癌細胞株RKO和HCT116 (均3 × 103個/孔)均勻鋪于96孔板上。用不同濃度梯度(0、1、2、4 μmol·L-1)的T4O和4 μmol·L-1的5-Fu處理上述細胞，每種細胞的復孔數(shù)為6個；24 h后，配制CCK-8檢測液(CCK-8 液與含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基以1 ∶9比例混勻)，棄原培養(yǎng)基，每孔加上述檢測液100 μL，再次放入養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h。開啟酶標儀，波長調(diào)為450 nm，讀取OD值。每種細胞的相對增殖百分比為實驗組OD值與空白組OD值的差值除對照組OD值與空白組OD值的差值的百分比。

1.2.3克隆平板實驗檢測T4O對各細胞克隆形成能力的影響 RKO和HCT116(1 × 103個/孔)均勻接種于6孔板中。培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，貼壁后用不同濃度的(0、1、2、4 μmol·L-1)的T4O和4 μmol·L-1的5-Fu處理上述細胞。培養(yǎng)14 d后，換液后用含4 %的多聚甲醛溶液固定20 min，再用0.5%結晶紫常溫染色25 min。干燥處風干并拍照，計算上述細胞的克隆形成數(shù)并記錄。

1.2.4運用流式細胞術檢測T4O對上述細胞凋亡的影響 結直腸癌細胞RKO和HCT116(均3×105個/孔)接種于6孔板中。待細胞生長貼壁后，分別用不同濃度(0、1、2、4 μmol·L-1)的T4O和4 μmol·L-1的5-Fu處理上述細胞。24 h后，用無EDTA的胰酶消化細胞后，以含10%濃度的FBS中和后，收集于1.5 mL的離心管中。1 000 r·min-1離心5 min，PBS洗滌2次后，轉移至流式專用管(黑色)中。加入含2.5 μL Annexin V和5 μL PI的binding buff液，在室溫孵育30 min后，流式細胞儀中檢測細胞的凋亡情況。凋亡率為細胞位于右上和右下象限的比例。

1.2.5利用流式細胞實驗檢測T4O對各細胞周期的影響 RKO和HCT116均勻鋪于6孔板中(3×105個/孔)。待細胞生長貼壁后，分別用不同濃度的T4O(0、1、2、4 μmol·L-1)和4 μmol·L-1的5-Fu處理上述細胞。24 h后，用無EDTA的胰酶消化細胞后，以含10%濃度的FBS中和后，收集于1.5 mL的離心管中。1 000 r·min-1離心5 min，PBS洗滌2次后，加入75%的乙醇并在-20 ℃的環(huán)境中放置24 h。離心后棄乙醇，PBS洗滌2次，轉移細胞至流式專用管(黑色)中，加入PI檢測液。常溫培養(yǎng)30 min，流式細胞儀測不同細胞在生長周期(G1、S和G2/M期)中的比率。

1.2.6劃痕愈合實驗檢測T4O對結直腸癌細胞的遷移能力的影響 結直腸癌細胞RKO和HCT116(均2×105個/孔)均勻鋪于6孔板內(nèi)。細胞狀態(tài)佳且密度達95%～100%時，饑餓處理(無血清培養(yǎng))24 h。10 μL槍頭輕劃一直線，PBS清洗3次，需拍下0 h各細胞的劃痕圖片，分別用不同濃度的T4O(0、1、2、4 μmol·L-1)和4 μmol·L-1的5-Fu處理上述細胞，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h，換液后再次拍下圖片。精確測量劃痕0 h和劃痕24 h兩個時間點的面積(ImageJ軟件測量)，計算同一處理組 0 h與24 h的劃痕面積之差即為24 h 內(nèi)劃痕的愈合面積。各藥物濃度處理組24 h內(nèi)劃痕愈合面積與對照組24 h內(nèi)劃痕愈合面積的百分比即為相對遷移率。

1.2.7Transwell檢測經(jīng)T4O處理后細胞的侵襲能力 在Transwell上室中鋪Matrigel膠，分別鋪300 μL的RKO和HCT116的細胞懸液(含4×105個細胞)，上室中細胞用T4O(0、1、2、4 μmol·L-1)和4 μmol·L-1的5-Fu處理。下室加入700 μL含10% FBS的完全培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h，棄舊液，4 %多聚甲醛常溫固定25 min，0.5%結晶紫常溫染色30 min，PBS洗3次，風干。計數(shù)細胞侵襲數(shù)(顯微鏡放大100倍隨機拍取4個視野)。

1.2.8免疫印跡實驗檢測細胞中E-cadherin、N-cadherin、p21、Cyclin B1、Cleave-Caspase7和NR3C1蛋白的表達 RKO和 HCT116分別用RIPA(含1% PMSF)裂解細胞，定量后用Loading buff進行樣本制備。每孔加入25 μg蛋白樣本，行SDS-PAGE分離，濕轉發(fā)法轉移至PVDF膜后，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h。分別加入E-Cadherin抗體、N-Cadherin抗體、CyclinB1抗體、p21抗體、Caspase7抗體(稀釋度1 ∶1 000)、cleaved-Caspase7抗體(稀釋度1 ∶500)、α-tublin單克隆抗體(稀釋度1 ∶2 000)和NR3C1單克隆抗體(稀釋度1 ∶1 000)等抗體，4 ℃下孵育18 h。PBST清洗。用相應二抗室溫孵育2 h，PBST洗滌，化學發(fā)光法曝光，檢測各蛋白條帶的灰度值，實驗重復3次。

1.2.9T4O靶點分析 根據(jù)T4O的藥效團，利用在線工具Swissprediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和TargetNet(http://targetnet.scbdd.com/)分析預測T4O的蛋白靶點。此外，T4O作用靶點在Cytoscape軟件(version)中生成。進一步對靶點進行計算機分子對接分析，計算靶點與T4O的結合得分。計算機分子操作步驟如下：(1)從Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)和PubMed compound(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/11230)中下載NR3C1蛋白(檢索代號：5NFP)和T4O的3D結構圖。在Autodock軟件中，清除原配體后，進行柔性對接。結合得分負值越大則結合時釋放能量越多，結合越穩(wěn)定。

1.2.10免疫印跡檢測NR3C1蛋白的降解率 用100 μg·L-1放線菌酮(CHX)抑制RKO和 HCT116細胞的蛋白翻譯，同時分別給予等體積DMSO和2 μmol·L-1T4O處理0、1、2和4 h后，RIPA裂解細胞，提取蛋白樣本，行免疫印跡實驗檢測Rko和 Hct116細胞經(jīng)DMSO和T4O處理后每個時間段NR3C1的蛋白水平變化。

1.2.11細胞轉染 結腸癌RKO和HCT116細胞鋪于6孔板中，待匯合度達到60%～70%時，棄掉原來培養(yǎng)基，更換成新鮮的培養(yǎng)基。用2.5 μL的脂質體3000分別與2.5 μL的NC和si-NR3C1配成轉染混合液。各孔分別加入NC和si-NR3C1轉染混合液后，在37 ℃培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基。

1.2.12劃痕實驗檢測沉默NR3C1對T4O介導的遷移抑制的影響 NC和si-NR3C1組結直腸癌細胞RKO和HCT116(均2×105個/孔)均勻鋪于6孔板內(nèi)。細胞狀態(tài)佳且密度達95%～100%時，饑餓處理(無血清培養(yǎng))24 h。10 μL槍頭輕劃一直線，PBS清洗3次，需拍下0 h各細胞的劃痕圖片，分別以4 μmol·L-1的T4O和等體積DMSO處理上述細胞24 h。余步驟同“1.2.6”項。

1.2.13CCK-8實驗檢測沉默NR3C1對T4O介導的增殖抑制的影響 NC和si-NR3C1組RKO和HCT116 (均3×103個/孔)細胞均勻鋪于96孔板上。以4 μmol·L-1的T4O和等體積DMSO處理上述細胞24 h，每種細胞的復孔數(shù)為6個。余步驟同“1.2.2”項。

2 結果

2.1 T4O抑制結直腸癌細胞RKO和HCT116的增殖Fig 1 CCK-8 檢測結果顯示，用濃度為0(DMSO)、1、2和4 μmol·L-1的T4O以及4 μmol·L-15-Fu處理細胞，24 h后，各組RKO細胞的相對增殖率分別為(100±7.0) %、(73.8±8.6) %、(59.2±7.1) %、(47.6±3.5) %和(59.5±2.0)%;各組HCT116細胞的相對增殖率分別為(100±12.5) %、(85.9±13.4) %、(73.4±9.6) %、(45.5±1.4) %和(59.7±2.7)%。與對照組相比，T4O處理后的RKO和HCT116細胞，增殖率明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；與4 μmol·L-15-Fu的陽性藥物處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組細胞的增殖率明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。結果提示，T4O明顯抑制結直腸癌細胞RKO和HCT116的增殖，且較陽性藥5-Fu明顯。

2.2 T4O抑制結直腸癌細胞RKO和HCT116的克隆形成能力如Fig 2顯示，用0、1、2和4 μmol·L-1的T4O以及4 μmol·L-15-Fu分別處理RKO和HCT116細胞14 d后，各組RKO細胞克隆形成數(shù)依次為(491±38)個、(408±34)個、(312±39)個、(220±27)個和(350±36)個；各組HCT116細胞克隆形成數(shù)依次為(520±43)個、(440±36)個、(325±40)個、(85±13)個和(370 ±35)個。相比較于對照組，T4O處理過的細胞，克隆形成數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；與4 μmol·L-1的5-Fu陽性藥處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組細胞的克隆形成能力明顯減少，差異具備統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。結果提示，T4O明顯抑制結直腸癌細胞RKO和HCT116的克隆形成能力，且較陽性藥5-Fu明顯。

Fig 1 Effects of different concentrations of T4O on proliferation of human colorectal cancer cells RKO and HCT116 detected by CCK-8 assay n=3)

2.3 T4O促進RKO和HCT16的凋亡凋亡檢測結果(Fig 3)顯示，用濃度分別為0、1、2和4 μmol·L-1的T4O以及4 μmol·L-1的5-Fu處理細胞24 h后，各組RKO細胞凋亡率分別為(3.06±0.51) %、(6.70±0.92) %、(9.20±1.32) %、(20.00±2.41) %和(15.59±1.6) % ; 各組HCT16細胞凋亡率分別為( 1.98±0.20) %、(3.97±0.41) %、(7.55±0.76) %、(19.42±1.9) % 和(8.17±0.8)%。T4O處理組與對照組相比，其凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義，P<0. 05；與4 μmol·L-15-Fu 的處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組細胞凋亡明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義，P<0. 05。結果提示，T4O 明顯促進結直腸癌細胞RKO和HCT116的凋亡，且較陽性藥5-Fu顯著。

Fig 2 Effects of T4O on colony formation of human colorectal cancer cells RKO and HCT116 detected by colony formation assay n=3)

Fig 3 Effects of T4O on apoptosis of RKO and HCT116 detected by flow cytometry n=3)*P<0.05,**P<0. 01 vs control, ##P<0. 01 vs 5-Fu.

2.4 T4O誘導RKO和HCT116阻滯在G1期流式細胞周期實驗結果(Fig 4)顯示，用0、1、2和4 μmol·L-1的T4O以及4 μmol·L-1的5-Fu處理細胞24 h后，各組RKO細胞在G1期的百分比分別為(41.98±2.3) %、(44.63±2.6) %、(47.22±2.7) %、(57.54±3.1) %和(47.26±2.1) %，在S期的百分比分別為(40.93±1.9) %、( 36.23±1.6) %、(36.04±1.5) %、(25.33±1.3) %和(40.52±2) %，在G2/M期的百分比分別為(15.54±0.7) % 、(16.68±0.8) %、(15.12±0.7) %、(16.58±0.8) %和(8.91±3.3) %；各組HCT16細胞在G1期的百分比分別為(43.80±2.3) %、(53.51±2.8) %、(54.28±2.9) %、(62.18±3.3)%和(47.5±3.2)%，在S期的百分比分別為(30.32±2.0) %、(23.86±1.9) %、(18.18±1.6) %、(14.05±1.4) %和(38.9 ±3.1) %，在G2/M期的百分比分別為(18.42±1.7) %、(18.46±1.7) %、(19.72±1.8) %、(18.41±1.7) %和(13.4±2.1) %。與各細胞系的對照組相比，不同濃度的T40處理后，RKO和HCT116在G1期的細胞比例明顯增加，在S期的比例明顯減少。差異均具有統(tǒng)計學意義，P均<0.05；與4 μmol·L-15-Fu的處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組細胞的G1期細胞比例明顯增加，差異具備統(tǒng)計學意義，P<0. 01。提示，T4O誘導直腸癌細胞RKO和HCT116阻滯在G1期，且其作用較同濃度5-Fu明顯。

2.5 T4O明顯抑制結直腸癌細胞RKO和HCT116的遷移Fig 5劃痕愈合實驗結果顯示，將0、1、2和4 μmol·L-1的T4O以及4 μmol·L-1的5-Fu 處理細胞24 h后，各組RKO細胞的相對遷移率分別為(100±14.2) %、(75.5±9.6) %、(69.8±3.9) %、(28.7±3.9) % 和(64.1±6.3) %；各組HCT116細胞的相對遷移率分別為(100±4.3) % 、(72.3±1.9) %、(43.8±3.2) %、(6.1±1.9) %和(67.0±7.0) %。與對照組相比，T4O處理組細胞遷移率減少，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；與4 μmol·L-1的5-Fu的處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組細胞的遷移能力明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。結果提示，T4O明顯減少結直腸癌細胞RKO和HCT116的遷移能力，且較陽性藥5-Fu顯著。

Fig 4 Effects of T4O on cell cycle of RKO and HCT116 cells detected by flow cytometry n=3)*P<0. 05, **P<0. 01 vs control, ##P<0. 01 vs 5-Fu.

2.6 T4O明顯抑制結直腸癌細胞RKO和HCT116的侵襲能力Fig 6 Transwell小室實驗結果顯示，用濃度為0、1、2和4 μmol·L-1的T4O以及4 μmol·L-15-Fu處理RKO和HCT116細胞，24 h后，各組RKO細胞每視野下侵襲過膜的細胞數(shù)為(720±42)個、(460±28)個、(300±19)個、(40±4)個和(200±25)個；各組HCT116細胞侵襲過膜的細胞數(shù)為(540±34)個、(392±23)個、(322±21)個、(76±9)個和(350±31)個。與對照組相比，T4O處理組侵襲細胞數(shù)量均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)；與4 μmol·L-1的5-Fu的處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組細胞的侵襲能力明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。結果提示，T4O 明顯減少結直腸癌細胞RKO和HCT116的侵襲能力，且較陽性藥5-Fu明顯。

2.7 T4O對E-Cadherin、N-Cadherin、CyclinB1、P21、cleaved-Caspase7表達的影響用不同濃度(0、1、2、4 μmol·L-1) 的T4O以及4 μmol·L-15-Fu處理結直腸癌細胞RKO和HCT16后，F(xiàn)ig 7免疫印跡實驗檢測結果顯示，與對照組相比，各濃度T4O處理組N-Cadherin和CyclinB1的相對表達量均見明顯減少， E-Cadherin、p21和cleaved-Caspase7蛋白的相對表達水平均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)；此外，與4 μmol·L-1的5-Fu處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組N-Cadherin和CyclinB1的相對表達量均見明顯減少，E-Cadherin和cleaved-Caspase7蛋白的相對表達水平均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)。

2.8 NR3C1可能為T4O的關鍵作用靶點根據(jù)T4O的藥效團，我們利用在線軟件 Swissprediction與TargetNet，預測T4O可能的作用靶點。結果發(fā)現(xiàn)，T4O有10個可能的作用靶點(Fig 8A-B)。其中，T4O與NR3C1的對接結合分數(shù)最高，為(Fig 8C，Tab 1)。提示，NR3C1可能是T4O的重要作用靶點。

Fig 5 Effects of T4O on migration of human colorectal cancer cells RKO and HCT116 determined by wound healing assay ( × 40) n=3)

Black lines indicated 50 μm.*P<0. 05;**P<0. 01vscontrol;##P<0. 01vs5-Fu.

Fig 6 Effects of T4O on invasion of T4O on RKO and HCT116 cells determined by Transwell invasion assay ( × 40) n=3)

Fig 7 Effects of T4O on protein level of E-Cadherin, N-Cadherin, CyclinB1, p21, cleaved-Caspase7 and Caspase7 in RKO and HCT116 cells detected by Western blot n=3)

2.9 T4O增加NR3C1的表達及蛋白穩(wěn)定性基于NR3C1可能是T4O的重要靶點，我們探究T4O對結直腸癌RKO和HCT116細胞中NR3C1蛋白的表達影響。結果提示(Fig 9A)，T4O處理后NR3C1蛋白的表達量明顯增加。此外，通過CHX抑制蛋白的合成，我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，T4O處理后NR3C1蛋白的降解率明顯降低(Fig 9B)。提示，T4O具有增加NR3C1蛋白穩(wěn)定性的作用。

2.10 沉默NR3C1能夠緩解T4O介導的遷移和侵襲抑制通過構建NR3C1沉默細胞株，我們發(fā)現(xiàn)si-NR3C1能夠明顯抑制T4O介導的NR3C1表達量的增多(Fig 10A)。通過劃痕實驗(Fig 10B-C)，我們發(fā)現(xiàn)NC+DMSO、NC+T4O和si-NR3C1+T4O組RKO細胞的遷移率分別為(100±15.2) %、(48.7±9.3) %和(73.7±9) %；NC+DMSO、NC+T4O和si-NR3C1+T4O組HCT116細胞的遷移率分別為(100±9.4) %、(50±4.6) %和(90±2.6) %;與NC+T4O組相比，si-NR3C1+T4O組細胞的遷移率均明顯增強，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。此外，通過CCK-8實驗(Fig 10D)，我們發(fā)現(xiàn)，NC+DMSO、NC+T4O和si-NR3C1+T4O組RKO細胞的增殖率分別為(100±6.4) %、(58.6±4.3) %和(92.5±7.4) %；NC+DMSO、NC+T4O和si-NR3C1+T4O組HCT116細胞的增殖率分別為(99.6±3.1) %、(56.1±3) %和(84.7±3) %；與NC+T4O組相比，si-NR3C1+T4O組細胞的增殖率均明顯增強，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示，沉默NR3C1的表達能夠明顯緩解T4O介導的結腸癌細胞的遷移和增殖抑制。

Tab 1 Docking score between T4O and each target

3 討論

結直腸癌患者的5年生存率低，中晚期患者多低于30%。當前，放化療行手術切除是結直腸癌臨床治療的主要措施。放化療殺滅或抑制腫瘤，提高治愈機會，但同時會導致患者機體免疫力的下降，腫瘤易復發(fā)[8]。此外，放化療導致的肝腎心等副作用較多。相對而言，有些中醫(yī)藥可發(fā)揮抗腫瘤作用，同時提高患者的免疫力[9]。因此，從中藥或其他天然產(chǎn)物中挖掘有效抗結直腸癌成分，開發(fā)結直腸癌治療藥物，是值得探索的治療方法。

T4O是中藥姜黃的有效成分之一[10]，已經(jīng)通過FDA批準，成為抗寄生蟲感染及治療皮膚真菌病的藥物，在臨床上廣泛應用；此外，T4O有較高的安全性，可內(nèi)服和外用[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，T4O亦具有良好的抗腫瘤作用。T4O可通過抑制P-膜蛋白的表達，減少黑色素瘤對化療藥物的耐受性[12]。T4O可誘導人白血病HL-60細胞出現(xiàn)過度自噬，進而導致凋亡[13]。本研究在結直腸癌細胞RKO及HCT116中進行的細胞功能學實驗，發(fā)現(xiàn)T4O 可抑制RKO及HCT116的惡性生物學能力，誘導細胞凋亡和細胞阻滯在G1期，且在同濃度下較陽性藥物5-Fu明顯。研究表明，T4O具有良好的體外抗結直腸癌活性。

Fig 8 Prediction of target proteins of T4O action(A-B) and molecular docking between T4O and NR3C1( C).

Fig 9 Effects of T4O on protein level and degradation rate of NR3C1 in RKO and HCT116 cells detected by Western blot n=3)

網(wǎng)絡藥理學和計算機分子對接技術是通過生物信息學手段，預測和模擬藥物分子與靶蛋白之間的相互作用，為分子的作用提供間接證據(jù)[14]。基于T4O的藥效團分析，本研究發(fā)現(xiàn)了T4O可能有10個潛在作用靶點。對靶點與T4O進行分子對接驗證，發(fā)現(xiàn)T4O與NR3C1的對接得分最高，提示T4O與NR3C1的結合很穩(wěn)定[15]。NR3C1基因是位于人體 5號染色體上，由9個外顯子構成，其編碼的蛋白屬于糖皮質激素受體，也是核激素受體超家族的一員[16]。NR3C1蛋白在多種腫瘤扮演著抑癌基因的角色，如胃癌、乳腺癌以及結直腸癌等[17]。此外，多項研究表明，多種腫瘤細胞內(nèi)的調(diào)控機制導致NR3C1蛋白在腫瘤組織的表達量明顯減少，如異常的DNA甲基化、基因突變及蛋白酶體降解等[17]。因此，誘導抑癌蛋白NR3C1表達增加或活性增加是治療腫瘤的一種治療策略。進一步，我們用T4O處理結直腸癌細胞，發(fā)現(xiàn)T4O能夠明顯促進NR3C1的表達。此外，T4O處理后，NR3C1的降解速率明顯降低。因此，我們推測：T4O可能與NR3C1結合，封閉了NR3C1上一些蛋白酶體的降解位點，進而減少蛋白酶體對NR3C1的降解，進而增加NR3C1的表達量。為進一步探究NR3C1是否參與T4O介導的功能學過程，我們構建NR3C1沉默的RKO和HCT116細胞株,通過功能學實驗發(fā)現(xiàn)，沉默NR3C1的表達能夠明顯緩解T4O對結腸癌RKO和HCT116細胞遷移和侵襲的抑制。

Fig 10 Knockdown of NR3C1 relieved inhibitory effects of T4O on migration and proliferation of RKO and HCT116 cells n=3)

綜上所述，T4O可能通過延緩NR3C1蛋白的降解，進而抑制結直腸癌細胞的惡性行為，誘導其凋亡和G1期阻滯。T4O具有明顯的抗結直腸癌作用，有望成為臨床治療結直腸癌的輔佐用藥之一。