甜菜單胚雄性不育系與保持系花藥及小孢子發生的超微結構觀察

王華忠，吳則東，韓英

（1.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；2.中國農業科學院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱150080；3.中國農業科學院甜菜研究所/黑龍江大學農作物研究院，哈爾濱150080）

甜菜單胚雄性不育系與保持系花藥及小孢子發生的超微結構觀察

王華忠1，2，3，吳則東1，2，3，韓英1，2，3

（1.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；2.中國農業科學院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱150080；3.中國農業科學院甜菜研究所/黑龍江大學農作物研究院，哈爾濱150080）

為闡明甜菜單胚雄性不育系和保持系花藥及小孢子發育的超微結構差異，以自育的甜菜單胚細胞質雄性不育系（CMS系）TB9-CMS和保持系（O型系）TB9-O為試驗材料，在甜菜花芽分化、現蕾初期、開花初期分別進行4次花蕾取樣，電子顯微鏡觀察花藥及小孢子發育過程的超微結構差異。結果表明，甜菜單胚CMS系與O型系花藥和小孢子發育過程的超微結構存在明顯差異。甜菜單胚CMS系花藥壁產生初始期與O型系相似，但小孢子母細胞的數量較少，液泡化明顯；絨氈層發育初期也形成烏氏體原始顆粒，但僅維持初始狀態而停止發育；絨氈層在四分體期收縮離位，瓦解內移；小孢子母細胞形成四分體后，胼胝質壁較厚，小孢子逐漸變異開始退化。觀察還發現，甜菜絨氈層細胞間以及形成四分體的胼胝質壁間有胞間連絲結構。

單胚甜菜；雄性不育；花藥；小孢子發生；超微結構

我國對甜菜細胞質雄性不育的研究和利用起步較晚，20世紀70年代初期才開始進行。特別是對于單胚甜菜雄性不育的細胞學以及超微結構的研究尤為偏少。因此，本研究對單胚甜菜雄性不育機制的基礎研究和雜種優勢利用具有重要意義。甜菜細胞質雄性不育于1942年由F.Owen發現[1，2]，Savitsky發現單胚種以后，單胚與雄性不育相結合的品種選育開始盛行[1，2]。對甜菜雄性不育花藥的研究，我國桂明珠等[3-5]對甜菜多胚及單胚雄性不育系與保持系雄性器官進行了形態學觀察，申家恒[6]觀察了甜菜正常發育的大小孢子發生和雌雄配子體發育。Bedinger[7]對甜菜雄性不育花藥的解剖學觀察發現，甜菜不同來源不同類型的雄性不育系，在小孢子單核期小孢子發育受到限制，表現為細胞肥大或絨氈層由細胞型轉化為原生質型。Hallden C[8，9]用光學和透射電子顯微鏡觀察發現，CMS較雄性可育的花藥發育模式存在更大的變異力。在CMS花藥減數分裂早前期觀察到絨氈層細胞降解或不規則增生，其它早期異?，F象為小孢子母細胞出現大量小囊泡和混亂的染色質凝聚。Jossem B[10]利用掃描電子顯微鏡觀察，直到四分體期，雄性不育系小孢子發生均正常，小孢子從胼胝質壁釋放后發育受阻。中島博、細川定治[11，12]進行電子顯微鏡觀察認為，絨氈層產生烏氏體（Ubisch body）減少是導致雄性不育發生的原因。Majewska-Sawka A[13]利用電子顯微鏡觀察發現雄性不育株花藥發育異常表現為線粒體縮小，核糖體數減少，絨氈層不能形成烏氏體，烏氏體的缺乏導致小孢子外壁發育不完全等等。Hornsey K G[14]以及Powling A[15]從分子水平上發現甜菜O型系與CMS系線粒體DNA存在明顯差異。由于國外的報道對影響甜菜雄性不育的看法不甚一致，特別對絨氈層產生烏氏體的有無或多少還存在疑問，并且，國內對于單胚甜菜雄性不育花藥的超微結構觀察尚無報道。因此，本研究重點對甜菜雄性不育系和保持系發育過程中花藥及小孢子的超微結構進行比較研究。通過電子顯微鏡觀察，闡明甜菜單胚雄性不育系和保持系花藥及小孢子發育的細胞學以及超微結構的差異，明確絨氈層產生烏氏體的有無或多少，為甜菜單胚雄性不育的機制研究和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2005～2006年進行，試驗材料為中國農科院甜菜研究所自育的單胚甜菜細胞質雄性不育系（CMS系）TB9-CMS和保持系（O型系）TB9-O。CMS系及其O型系的單胚率均在98%以上，CMS系的不育率均達100%。

1.2 試驗方法

1.2.1 母根栽植取樣2005年培育母根，窖藏越冬春化后，2006年春季4月25日成對栽植CMS系及其O型系母根各100株。當甜菜花芽分化、現蕾初期、開花初期期間，分別于6月5日、6月8日、6月11日、6月14日對花穗進行4次取樣，每次取樣分別按照透射和掃描電鏡觀察的要求進行。

1.2.2 透射電鏡樣品的制備（1）固定：每次取花蕾40枚立即將材料置于2.5%戊二醛固定液中，在0～4℃條件下固定2～3 h后，用與配制固定液相應的緩沖液沖洗3次，再用2%四氧化鋨固定1～2 h，再用相應的緩沖液沖洗3次。（2）脫水：固定材料經系列乙醇進行脫水，即30%乙醇10 min→50%乙醇10 min→70%乙醇10 min→90%乙醇15 min→100%乙醇沖洗3次，每次15 min。（3）浸透、包埋與聚合：①浸透：經過脫水材料進行逐級滲透，即100%丙酮∶包埋劑=1∶1，室溫1 h；100%丙酮∶包埋劑=1∶2，室溫2 h；100%丙酮∶包埋劑=1∶3，室溫下過夜。②包埋：將包埋塊放入淺槽的前后兩端，寫好標簽入淺槽中，注入包埋劑。③聚合：將包埋好的膠囊，置于包埋膜上，放恒溫箱中，梯度聚合，溫度分別為37℃、45℃、60℃，時間分別為17 h、24 h、17 h。（4）切片，觀察：用超薄切片機切成薄片，將所有超薄切片經醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，將切片用JEM-1200EX透射電鏡觀察，并拍片紀錄。

1.2.3 掃描電鏡樣品制備材料用戊二醛固定后，用pH 6.8的磷酸緩沖液沖洗，用乙醇系列脫水，至100%乙醇后，用叔丁醇置換，再用冷凍干燥儀干燥；離子濺射鍍膜儀噴金，其厚度為最后制備的樣品用日立S-3400N掃描電鏡觀察。

2 觀察結果

甜菜CMS系及O型系小孢子發育的超微結構可人為劃分4個時期，觀察結果如下。

2.1 小孢子母細胞時期

2.1.1 O型系花藥橫切面觀察，O型系的花粉母細胞的數量較多，發育正常，花粉母細胞的細胞核大，核中的染色質分散，核仁明顯。細胞質濃厚，其中分布豐富的細胞器，主要是線粒體和質體，核糖體也很豐富。有時在小孢子母細胞的外壁上已有胼胝質物質沉積。在小孢子母細胞時期，絨氈層細胞比表皮、藥室內壁、中層細胞明顯增大，原生質濃厚，細胞器也較豐富，而其他各層細胞產生大液泡，將原生質擠至細胞周邊，并有較多的淀粉粒（圖1、2）。

1.O型系花藥橫切，示花藥壁與花粉母細胞

2.O型系花藥橫切，示花粉母細胞、花藥壁各層細胞清晰

3.CMS系花藥橫切，示各部細胞液泡化明顯

2.1.2 CMS系觀察表明，CMS系小孢子母細胞與O型系相比，花藥發育過程、結構大體相似。但CMS系花藥小孢子母細胞的數量較少，而另一個特點是液泡化程度明顯超過O型系。花藥的表皮、藥室內壁、中層液泡化，各層細胞中均有大的液泡產生。而絨氈層和花粉母細胞也產生數量較多的小液泡，花粉母細胞開始有退化現象（圖3、4）。

2.2 四分體時期

2.2.1 O型系小孢子母細胞經過減數分裂產生四分體。甜菜小孢子母細胞減數分裂屬于同時型，四分體的排列方式屬四面體型。四分體被胼胝質壁包圍，初期四分體之間可見到胞間連絲，每個細胞核大，核膜清晰，核仁明顯，細胞質和細胞器數量較多，此時小孢子的原外壁開始產生。絨氈層細胞內切向壁已開始降解，但仍含豐富的細胞器（圖5、6）。

4.CMS系花藥橫切，示各部細胞液泡化

5.O型系絨氈層細胞核分裂

6.O型系四分體，示胞間連絲

2.2.2 CMS系CMS系的四分體形成過程與O型系一致，即小孢子母細胞經過減數分裂產生的四分體，為同時型和四面體型。但是，四分體被厚厚一層胼胝質壁所包圍，小孢子之間也發現胞間連絲結構。四分孢子大小不甚整齊，有個別的小孢子開始退化，細胞質中產生多數小型液泡。小孢子外壁開始形成，此時絨氈層細胞變化明顯，絨氈層整體開始脫離中層，向內移動（圖7、8）。

7.CMS系絨氈層細胞徑向壁胞間連絲

8.CMS系四分體，示胼胝質壁較厚

9.O型系小孢子和絨氈層

2.3 單核小孢子時期

2.3.1 O型系在絨氈層細胞分泌β-1,3葡萄糖酶及胼胝質酶的作用下，使胼胝質壁融解消失，四分小孢子彼此散開。游離的小孢子含有一個大的細胞核，位于中央，核質、細胞質稠密，其內含有線粒體、質體、高爾基體及內質網等多種細胞器等。隨著小孢子繼續發育，細胞內逐漸出現液泡，內質網的數量也有所增加，小孢子的外壁基本形成（圖9、10）。與此同時，絨氈層細胞內含有大液泡，進一步發育，細胞質內的質體開始向造油體轉化，使內部結構模糊不清，出現一些顆粒狀物質，靠近內切向壁的一側出現烏氏體顆粒結構（圖11、12）。

10.O型系小孢子

11.O型系絨氈層與烏氏體

12.O型系烏氏體與花粉壁

2.3.2 CMS系隨著四分體胼胝質壁消失，小孢子散開后，小孢子發育遲緩，并且大部分小孢子明顯退化、瓦解。細胞質和細胞器逐漸減少、萎縮，液泡化明顯，進而細胞核逐漸破壞，輪廓不清，停止發育（圖13、14）。在小孢子停止發育，退化瓦解進程中，絨氈層細胞也開始退化瓦解。觀察發現小孢子發育不久，偶爾見到少量絨氈層在細胞核變形的同時，位于近切向壁一側出現明顯的線粒體質體，絨氈層發育初期也產生烏氏體原始顆粒，但僅維持初始狀態而停止發育（圖15）。且大部分絨氈層細胞逐漸退化，液泡化使細胞質不規整，細胞質細胞器破壞，徑向壁首先破壞，以后整個細胞瓦解，殘留的無壁結構的物質脫離中層，絨氈層整體向內移動（圖13）。

13.CMS系小孢子和絨氈層

14.CMS系小孢子核消失

15.CMS系絨氈層烏氏體顆粒

2.4 花粉的發育與敗育時期

2.4.1 O型系的花粉發育當小孢子產生以后，其內產生大的液泡，將細胞質擠到了細胞的一側，使小孢子處于不對稱的極性狀態，即核和細胞質、細胞器發生不均勻分布，常稱為小孢子單核靠邊期，為進行不等分裂作準備。此時細胞質內的細胞器比較豐富，主要有線粒體、質體及少量內質網等（圖16）。進而進行一次不均等的有絲分裂，產生2細胞型花粉，最后花粉內的生殖細胞又進行一次分裂，產生兩個精子，甜菜花粉屬3-C型花粉。在發達的外壁形成之后，又產生較薄的內壁；甜菜花粉為圓球狀，直徑10～15nm，多萌發孔30～48個，平均38.2個（圖17）。甜菜O型系花粉形成過程中，絨氈層屬腺質絨氈層，在原位耗盡瓦解。

16.O型系花粉內細胞器，示線粒體、淀粉

17.O型系成熟花粉

18.CMS系敗育花粉與絨氈層細胞殘體

2.4.2 CMS系花粉敗育CMS系小孢子分離后，細胞停止正常發育，處于不斷瓦解的過程，細胞質、細胞核不斷萎縮，液泡化極為明顯，小孢子外壁也不再增厚，敗育的花粉往往是空癟的。在小孢子敗育過程中，絨氈層呈無定形的顆粒狀，殘余物質進入花粉囊內，混入敗育花粉其間而枯萎（圖18、19）。

19.CMS系絨氈層殘余物質

3 討論

3.1 關于烏氏體的發育

在甜菜O型系花藥發育過程中，在小孢子四分體分離以后，花藥壁內絨氈層細胞的內切向壁附近，產生大量的近等直徑的顆粒即烏氏體；而在CMS系的發育過程中，絨氈層開始也形成烏氏體原始顆粒，但在其后發生內移和細胞瓦解等過程中烏氏體不發育，最后隨絨氈層細胞一起粘連而枯萎。觀察發現，甜菜的烏氏體的形狀不甚規則，而中央透明的部分常常偏向一側，這與已報道的小麥烏氏體的形態有所區別[16，17]，小麥烏氏體超微結構是中央部分透明，周圍是一層厚的由孢粉素組成的壁。甜菜O型系的烏氏體成熟后似乎還要噴射或釋放什么顆粒狀物質，有待繼續研究。這是本研究的又一發現。

3.2 關于四分體時期胼胝質壁間的胞間連絲

據研究表明[18-20]，在絕大多數植物中，從四分體時期開始，到小孢子形成，由于胼胝質壁的分組，細胞之間無聯系，而且繼續發育，甚至花粉成熟和萌發都是以四分體為單位進行。但在蘭科及少數其它植物中在小孢子之間存在著細胞質通道。除了復合花粉植物外，其它胼胝質壁以后無胞間連絲，失去小孢子之間的聯系。但本研究觀察意外發現，甜菜形成四分體的胼胝質壁中有胞間連絲的結構。此現象有待深入研究。

4 結論

甜菜CMS系花藥壁產生始期與O型系相似，在CMS系的發育過程中，絨氈層開始也形成烏氏體原始顆粒，但僅維持初始狀態不能發育而枯萎；甜菜單胚CMS花藥和花粉敗育的主要表現是絨氈層細胞和小孢子母細胞液泡化明顯；絨氈層發育過程，收縮離位，瓦解內移；小孢子母細胞形成四分體后，胼胝質壁發達，小孢子逐漸變異開始退化，細胞質與細胞核逐漸收縮，直至空虛無物。甜菜形成四分體的胼胝質壁中有胞間連絲結構。

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Ultrastructural Observations on the Anther and Microsporogenesis in Monogerm CMS Lines and Its O-type Lines of Sugarbeet

WANG Hua-zhong1,2,3,WU Ze-dong1,2,3,HAN Ying1,2,3
(1.The Key Laboratory of Sugarbeet Genetic Breeding,Heilongjiang University,Harbin 150080,China;2.The Key Laboratory of North Sugar Crop Resource and Utilization,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080,China;3.Sugarbeet Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences/Institute for Crop Research,Heilongjiang University,Harbin 150080,China)

Ultrastructural differences were observed on the anther and microspore genesis in monogerm cytoplamsic male sterile（CMS）lines and its O-type lines of sugarbeet.Ultrastructural characteristics of anther and microsporogenesis at flower bud differentiation,early budding stage and early flower stage of CMS lines and O-type lines in sugarbeet were described in detail under electron microscope.Though monogerm CMS lines and its O-type lines ofsugarbeethad a similar structure in initial period of anther wall,microspore mother cells were clearly vacuolized and fewer in numbers.The early development of tapetum,original particles of ubisch bodies were formed,which maintain their initial state.Morever,tapetum was contracted into dislocation and collapsed at tetrad stage.Callose wall was thick after microspore mother cells formed into tetrad.Meanwhile,microspores were varied gradually and degraded.Plasmodesmi were detected among the tapetum cells and callose wallofthe tetrad.

Monogerm sugarbeet;Male sterility;Anther;Microsporogenesis;Ultrastructure

S566.301

A

1007-2624（2010）01-0005-05

2009-10-16

國家“863”計劃項目（2001AA241192）“糖料新品種選育”課題；國家科技支撐計劃項目（2006BAD01A06）“高產優質專用甜菜育種技術研究及新品種選育”。

王華忠（1957-），男，遼寧省西豐縣人，研究員，博士，從事甜菜遺傳育種研究。E-mail:wwhhzz0451@sohu.com。