超臨界CO2狀態(tài)下生物酶法催化合成植物甾醇酯

王騰宇，胡立志，孫 博，劉 晶，于殿宇,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030)

超臨界CO2狀態(tài)下生物酶法催化合成植物甾醇酯

王騰宇1，胡立志2，孫 博1，劉 晶1，于殿宇1,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030)

對葵花油與植物甾醇在CO2超臨界狀態(tài)下合成植物甾醇酯的工藝進行研究。采用Novozym 435脂肪酶做催化劑，進行酯化反應(yīng)。通過單因素與正交試驗，確定了最佳工藝條件：反應(yīng)溫度85℃、植物甾醇質(zhì)量分數(shù)5%、反應(yīng)壓力8MPa、反應(yīng)時間1h、攪拌速度600r/min，在此條件下，轉(zhuǎn)換率為92.1%。與常規(guī)方法相比，本工藝降低了反應(yīng)溫度，縮短了反應(yīng)時間。

植物甾醇；葵花油；超臨界CO2；酯化反應(yīng)；脂肪酶

甾醇是甾族化合物其中的一類，由于其常態(tài)為固態(tài)所以又被稱作固醇，主要以游離、高級脂肪酸酯、苷這三種形式存在于動物、植物和微生物體內(nèi)。至今已發(fā)現(xiàn)100多種植物甾醇，含量較豐富的主要有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇[1-2]。

相關(guān)研究表明，植物甾醇可以有效地降低血液中的膽固醇含量，從而降低心腦血管疾病的產(chǎn)生，是一種行之有效的保健食品。植物甾醇具有抗癌、抗動脈粥樣硬化、抗氧化和抗炎等功效，被廣泛應(yīng)用于制藥、保健品、化妝品、動植物生長激素以及化工、紡織等各領(lǐng)域[3-6]。國際營養(yǎng)學會推薦的未來十大功能性營養(yǎng)成分中就包括植物甾醇[7]。

雖然植物甾醇具有降低血清膽甾醇水平的功效，但游離植物甾醇在水和油脂中的低溶解性限制了它在食品中的實際作用[8]。植物甾醇酯在植物油脂中的含量非常少，但是植物甾醇酯具有更優(yōu)的脂親和性和更佳的降膽固醇效果[9]。這不僅方便甾醇在含脂食品中的傳遞，生物利用率高，溶解度好，還可以改善產(chǎn)品的外觀及口感，因此備受青睞。臨床試驗表明，成人每天只要攝入1.3g以上植物甾醇酯即可達到降低膽固醇的目的[10-11]。

通常，甾醇酯是通過相應(yīng)的甾醇與脂肪酸酯化、脂肪酸甲酯或三酰甘油酯交換、脂肪酸鹵化物或脂肪酸酐反應(yīng)來制取[12-13]。Katsunori等[14]、裘愛泳等[15]分別采用脂肪酶催化甾醇與不飽和脂肪酸在含水的溶劑體系中反應(yīng)生產(chǎn)甾醇酯，關(guān)于植物油脂與植物甾醇在無溶劑體系中反應(yīng)合成植物甾醇酯的研究尚未見諸報導。本研究對超臨界CO2條件下葵花油和植物甾醇發(fā)生酯交換反應(yīng)合成植物甾醇酯的方法進行探索，考察超臨界CO2流

體下，反應(yīng)溫度、甾醇質(zhì)量分數(shù)、反應(yīng)壓力、反應(yīng)時間、攪拌速度對酯交換反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

植物甾醇 西安藍天生物工程有限責任公司；葵花油 大連圣基生物制品有限公司；Novozym 435脂肪酶丹麥Novozymes公司；二氧化碳(純度≥99.9%) 哈爾濱黎明氣體有限公司；其他試劑均為化學純。

高壓反應(yīng)釜 大連通達反應(yīng)釜廠；恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪高科儀器廠；LD4-2A低速離心機北京醫(yī)用離心機廠；XW-80A旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠；722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物甾醇酯的合成

精確稱量一定量的植物甾醇、葵花油和Novozym 435脂肪酶，連同轉(zhuǎn)子一同加入150mL高壓反應(yīng)釜中。將高壓反應(yīng)釜密封，通入CO2進行密閉性測試，再次通入CO2置換高壓反應(yīng)釜中的空氣3～5次，最后通入CO2并調(diào)整壓力。將高壓反應(yīng)釜置于集熱式磁力攪拌器中，調(diào)整溫度、攪拌速度，反應(yīng)一定時間。反應(yīng)完成后，將高壓反應(yīng)釜取出并冷卻至室溫，排出反應(yīng)釜內(nèi)空氣。取出產(chǎn)品，在3000～4000r/min條件離心20min，取出上層油脂制品。

1.2.2 標準曲線的制作

將甾醇溶解于乙酸酐中，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液并吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0mL分別置于10mL試管內(nèi)，在各管內(nèi)加入乙酸酐使總體積均達到4mL。加入2滴濃硫酸，30min后，在660nm波長處比色。以膽固醇質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，得出標準曲線。

1.2.3 轉(zhuǎn)換率的測定

將制取的植物甾醇酯3～4滴，置于25mL試管內(nèi)，準確記錄其質(zhì)量。加入4mL無水乙醇，0.5mL 50%氫氧化鉀溶液，在65℃恒溫水浴中皂化1h。皂化時每隔20～30min振搖一次使皂化完全。皂化完畢，取出試管，冷卻。加入3mL 5%氯化鈉溶液，10mL石油醚，蓋緊玻塞，在電動振蕩器上振搖2min，靜置分層(約需1h以上)。

取上層石油醚液2mL，置于10mL試管內(nèi)，在65℃水浴中用氮氣吹干，加入4mL乙酸酐，2滴濃硫酸，混勻，靜置20min后在660nm波長下比色，測得吸光度，在標準曲線上查出相應(yīng)的植物甾醇含量。

式中：X為轉(zhuǎn)換率/%；m為測得的吸光度在膽固醇標準線上顯示的膽固醇含量/μg；V為石油醚總體積/ mL；V1為取出的石油醚體積/mL；m1為稱取油樣品脂量/g；m2為稱取油脂中植物甾醇量/mg；m3為油脂制品量/g；m4為添加的植物甾醇量/mg；1/1000000為折算成每1g油脂制品植物甾醇酯毫克數(shù)。

1.2.4 各影響因素的分析與數(shù)據(jù)優(yōu)化

通過單因素試驗分析反應(yīng)溫度、植物甾醇質(zhì)量分數(shù)、反應(yīng)壓力、反應(yīng)時間以及攪拌速度對合成植物甾醇酯轉(zhuǎn)換率的影響，并采用正交助手軟件進行數(shù)據(jù)處理，分析得出最佳合成條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)換率的影響

圖1 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)換率的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on conversion rate

反應(yīng)溫度是影響轉(zhuǎn)換率的一個主要因素。在甾醇質(zhì)量分數(shù)10%、反應(yīng)壓力8MPa、反應(yīng)時間3h、攪拌速度300r/min、酶用量1%(m/m)條件下，考慮不同溫度對植物甾醇轉(zhuǎn)換率的影響。從圖1可以看出，在55～85℃這一區(qū)間內(nèi)，隨著溫度的增加，轉(zhuǎn)換率逐漸增加；再提高溫度，轉(zhuǎn)換率并未增加，且呈下降趨勢。所以，選擇反應(yīng)溫度為85℃。

2.1.2 甾醇質(zhì)量分數(shù)對轉(zhuǎn)換率的影響

植物甾醇質(zhì)量分數(shù)是影響轉(zhuǎn)換率的一個重要因素。在反應(yīng)溫度85℃、反應(yīng)壓力8MPa、反應(yīng)時間3h、攪拌速度300r/min、酶用量1%條件下，考慮不同植物甾醇含量對轉(zhuǎn)換率的影響。反應(yīng)需要足夠的反應(yīng)物，若植物甾醇過少則反應(yīng)不完全；若植物甾醇過多則不能夠很好地溶解于葵花油中，不僅轉(zhuǎn)換率不高，而且造成原料的浪費。從圖2可以看出，隨著植物甾醇質(zhì)量分數(shù)

的增加，轉(zhuǎn)換率明顯下降。所以，選擇甾醇質(zhì)量分數(shù)為5%。

圖2 植物甾醇質(zhì)量分數(shù)對轉(zhuǎn)換率的影響Fig.2 Effect of phytosterol concentration on conversion rate

2.1.3 反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)換率的影響

圖3 反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)換率的影響Fig.3 Effect of reaction time on conversion rate

反應(yīng)時間是影響植物甾醇酯交換反應(yīng)的另一主要因素。反應(yīng)的時間過短，酯交換反應(yīng)不完全；反應(yīng)時間過長，影響其品質(zhì)，并且會造成資源的浪費。在反應(yīng)溫度85℃、甾醇質(zhì)量分數(shù)5%、反應(yīng)壓力8MPa、攪拌速度300r/min、酶用量1%條件下，考慮不同反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)換率的影響。從圖3可以看出，隨著時間的增加，轉(zhuǎn)換率上升，但反應(yīng)時間超過1h后，轉(zhuǎn)換率提高緩慢。為了保證產(chǎn)品的質(zhì)量和節(jié)約資源，選擇反應(yīng)時間1h。

2.1.4 反應(yīng)壓力對轉(zhuǎn)換率的影響

圖4 反應(yīng)壓力對轉(zhuǎn)換率的影響Fig.4 Effect of reaction pressure on conversion rate

壓力也是超臨界酯交換反應(yīng)的又一主要影響因素，壓力的高低直接會影響到高壓反應(yīng)釜中反應(yīng)物的傳質(zhì)速度。壓力增大會很大程度上增加植物甾醇的溶解度，使其與葵花油在脂肪酶的催化下與催化劑充分接觸，從而促進酯交換反應(yīng)的發(fā)生，提高轉(zhuǎn)換率。在反應(yīng)溫度85℃、甾醇質(zhì)量分數(shù)5%、反應(yīng)時間1h、攪拌速度300r/min、酶用量1%條件下，考慮不同反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)換率的影響。從圖4可以看出，反應(yīng)壓力在8MPa時轉(zhuǎn)換率達到最大，再提高反應(yīng)壓力轉(zhuǎn)換率提高不大，并且壓力對超臨界設(shè)備的要求非常高，過高的壓力會增加設(shè)備的成本，從經(jīng)濟角度來看，選擇8MPa為最佳反應(yīng)壓力。

2.1.5 攪拌速度對轉(zhuǎn)換率的影響

圖5 不同攪拌速度對轉(zhuǎn)換率的影響Fig.5 Effect of stirring speed on conversion rate

攪拌可以增加催化劑與反應(yīng)物的接觸機率，有利于酯交換反應(yīng)進行。在反應(yīng)溫度8 5℃、甾醇質(zhì)量分數(shù)5%、反應(yīng)壓力8MPa、反應(yīng)時間1h、酶用量1%的條件下，考慮不同攪拌速度對轉(zhuǎn)換率的影響。從圖5可以看出，隨著攪拌速度的增加，轉(zhuǎn)換率呈上升的趨勢。但是，由于實驗室條件所限，選擇攪拌速度600r/min為最佳條件。

2.2 植物甾醇酯合成正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，得出影響酯交換反應(yīng)的主要因素，即反應(yīng)溫度、甾醇質(zhì)量分數(shù)、反應(yīng)壓力、反應(yīng)時間。選用L9(34)正交表進行正交試驗，攪拌速度為600r/min，酶用量1%，確定最佳反應(yīng)條件，以得到轉(zhuǎn)換率較高的油脂制品。因素水平表見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal experiments

從表2可以看出，各因素對甾醇酯交換反應(yīng)的影響主次順序為：甾醇質(zhì)量分數(shù)＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)壓力＞反

應(yīng)時間，A2B1C3D3為最佳條件，即反應(yīng)溫度85℃、甾醇質(zhì)量分數(shù)5%、反應(yīng)壓力9MPa、反應(yīng)時間2h。按照此條件進行試驗，得到的轉(zhuǎn)換率為92.6%。但是，由于壓力越高對設(shè)備的要求就越嚴格，并且單純的延長反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)換率的提高并不顯著，從節(jié)省能源，高效低耗的角度考慮，選擇最佳反應(yīng)壓力為8MPa、反應(yīng)時間為1h。在此條件下，轉(zhuǎn)換率為92.1%。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Design and results of orthogonal experiments

3 結(jié) 論

本實驗將超臨界CO2流體應(yīng)用于葵花油與植物甾醇的酯交換反應(yīng)中，結(jié)果表明：酶添加量的不同對轉(zhuǎn)換率的影響與常壓下合成植物甾醇酯相比較變化不大。植物甾醇酯的轉(zhuǎn)換率隨著壓力的升高而增加，但是達到8MPa以后，增長緩慢；甾醇質(zhì)量分數(shù)是一個非常重要的影響因素；同時，反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間也對轉(zhuǎn)換率有一定的影響。

通過單因素與正交試驗，確定了酯交換反應(yīng)的最佳工藝條件：反應(yīng)溫度85℃、植物甾醇質(zhì)量分數(shù)5%、反應(yīng)壓力9MPa、反應(yīng)時間2h、攪拌速度600r/min、酶用量1%。但是從有利于工業(yè)化生產(chǎn)的角度，選擇反應(yīng)溫度85℃、植物甾醇質(zhì)量分數(shù)5%、反應(yīng)壓力8MPa、反應(yīng)時間1h、攪拌速度600r/min、酶用量1%，所得轉(zhuǎn)換率92.1%。

本方法與常規(guī)合成法相比較，不僅降低了反應(yīng)溫度，而且提高了酯交換反應(yīng)的速度，使反應(yīng)時間相對常規(guī)方法合成的時間大大縮短。

[1]FERNADES P, CABRAL J M. Phytosterols: applications and recovery methods[J]. Bioresource Technology, 2007, 98: 2335-2350.

[2]KRITCHEVSKY D, SHIRLEY C, CHEN S C. Phytosterols-health benefits and potential concerns: a review[J]. Nutr Res, 2005, 25: 413-428.

[3]周寶蘭. 植物甾醇的應(yīng)用[J]. 中國油脂, 1992(4): 33-38.

[4]OKOLI C O, AKAH P A. Mechanisms of the anti-inflammatory activity of the leaf extracts of Culcasia scandens P. Beauv (Araceae)[J]. Pharmacol Biochem Behavior, 2004, 79(3): 473-481.

[5]NASHED B, YEGANEH B, HAYGLASS K T, et al. Antiatherogenic effects of dietary plant sterols are associated with inhibition of proinflammatory cytokine production in Apo E-KO mice[J]. J Nutr, 2005,135(10): 2438-2444.

[6]CHOI Y H, KONG K R, KIM Y A, et al. Induction of Bax and activation of caspases during beta-sitosterol-mediated apoptosis in human colon cancer cells[J]. Int J Oncol, 2003, 23: 1657-1662.

[7]BELISL F. Functional food science[J]. The Internal Life Sci Institute, 2002, 23(3): 113-116.

[8]陳茂彬, 黃琴, 吳謀成. 植物甾醇油酸酯產(chǎn)品的合成工藝研究[J]. 中國油脂, 2005, 30(6): 63-65.

[9]陳茂彬, 黃琴. 植物甾醇乙酸酯和植物甾醇油酸酯抗腫瘤作用初探[J]. 中國油脂, 2003, 28(9): 49-51.

[10]LEES A M, MOK H Y, LEES R S, et al. Plant sterols as cholesterollowering agents[J]. Atherosclerosis, 1977, 28(2): 325-328.

[11]RTEY C K, HIGGINS J D, JOHN D, et al. Stable salad dressings: US, 6123978[P]. 2000-09-06.

[12]唐進年, 趙明, 張盹明, 等. 發(fā)菜的生物學特性及資源保護[J]. 中國野生植物資源, 2000, 19(5): 20-24.

[13]白雪娟. 發(fā)菜多糖及其制品的初步研究[D]. 天津: 天津科技大學, 2005.

[14]KATSUNORI M, YOUICHI M, SHIRO O. Process for preparing fatty acid ester: Europe, 0195311A[P]. 1994-04-13.

[15]裘愛泳, 劉軍海. 酶催化合成植物甾醇酯和植物甾烷醇酯[J]. 中國油脂, 2003, 28(6): 25-27.

Lipase-catalyzed Synthesis of Phytosterol Ester in Supercritical CO2

WANG Teng-yu1，HU Li-zhi2，SUN Bo1，LIU Jing1，YU Dian-yu1,*
(1. College of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. National Research Center of Soybean Engineering & Technology, Harbin 150030, China)

In the supercritical CO2condition, the synthesis of phytosterol ester was investigated using sunflower oil and phytosterol as the materials and Novozym 435 lipase as the catalyst. The optimal esterification conditions were achieved through single factor and orthogonal experiments to be reaction temperature of 85 ℃, phytosterol concentration of 5%, reaction pressure of 8 MPa, reaction time of 1 h, stirring speed of 600 r/min, and lipase dosage of 1%. The conversion rate was up to 92.1% under the optimal reaction conditions. This study will provide a theoretical reference for the preparation of phytosterol ester.

phytosterol；sunflower oil；supercritical CO2；esterification；lipase

TS229

A

1002-6630(2010)22-0293-04

2010-03-20

2010黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目(WB09B201-1)

王騰宇(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為糧油加工。E-mail：wangtengyu@yahoo.cn

*通信作者：于殿宇(1964—)，男，教授，碩士，研究方向為大豆油脂加工技術(shù)。E-mail：dyyu2000@yahoo.com.cn