草酸對桃貯藏期抗性相關(guān)酶活性的誘導(dǎo)

張 闊，秦 文,*，李正國，彭春華

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400030；3.成都龍泉驛區(qū)果樹研究所，四川 成都 323700)

草酸對桃貯藏期抗性相關(guān)酶活性的誘導(dǎo)

張 闊1，秦 文1,*，李正國2，彭春華3

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400030；3.成都龍泉驛區(qū)果樹研究所，四川 成都 323700)

以栽培品種“皮球桃”為試材，采后以草酸溶液浸泡處理后，置于溫度為(1±1)、(4±1)、(8±1)℃的氣調(diào)庫貯藏，測定貯藏過程中部分抗性酶的活性以及丙二醛的含量，探討草酸、溫度等對氣調(diào)貯藏條件下的皮球桃采后抗性生理的影響。結(jié)果表明：與對照組相比，草酸處理能提高桃果SOD、CAT的活性，在貯藏中后期提高PPO的活性，對POD沒有直接影響，并使MDA的積累得到控制。以草酸(1±1)℃的處理組的效果最為明顯，說明草酸和低溫能在一定程度上提高桃果實的抗性。

草酸；抗性；酶活性；溫度

植物的誘導(dǎo)抗性之一是在外源因子作用下產(chǎn)生的反應(yīng)，目前對其的研究和應(yīng)用已成為一個熱門領(lǐng)域[1]。外源草酸是一種有效的非生物誘抗劑，不僅能誘導(dǎo)植物的局部抗病性，而且能誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗病性(induced systematic resistance，ISR)[2]。外源草酸在瓜果、馬鈴薯、水稻、煙草等方面的研究應(yīng)用都已取得了成功[3-5]。用40mmol/L草酸處理黃瓜，可提高黃瓜抗炭疽病的能力[6]。Yoruk等[7]報道了草酸可以影響多酚氧化酶PPO的活性，從而控制香蕉切片褐變的發(fā)生。Kayashima等[8]認為草酸可以作為一種天然的抗氧化劑應(yīng)用于自然或加工食物的貯藏中。鄭小林等[9]的研究結(jié)果表明草酸處理的“八月脆”桃果實貯藏效果較好，草酸可通過提高果實抗氧化防御系統(tǒng)能力和PPO活性來延緩果實成熟和增強抗病能力。深入研究草酸誘導(dǎo)抗病的機理，對草酸在果蔬貯藏保鮮生產(chǎn)上的應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

植物的抗病性與某些酶有重要關(guān)系。如氧化酶類(過氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO等)與植物抗病性密切相關(guān)，能將酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素等，提高植物抗病性[1]。超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、苯丙氨酸解氨酶PAL等都是常用來鑒定植物抗性的酶。本實驗以氣調(diào)貯藏下的皮球桃為材料，以多年的實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，選取3個溫度梯度進行氣調(diào)貯藏，初步探討草酸對抗性酶(POD、PPO、SOD、CAT)活性的誘導(dǎo)作用以及對丙二醛MDA的抑制效果，探明在不同溫度下草酸對桃的保鮮效果及系統(tǒng)抗病性誘導(dǎo)的能力，為皮球桃的采后貯運提供應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗原料桃品種為“皮球桃”，7月18日采摘于成都市龍泉驛。成熟度為七至八成，挑選大小均勻，無病蟲害和機械傷的果實，于當天運至氣調(diào)庫。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計

對桃果進行分類編號后，均勻分配于(1±1)、(4± 1)、(8±1)℃ 三個溫度的氣調(diào)單元庫內(nèi)，控制氣調(diào)庫條件：氣體成分1% O2＋5% CO2，相對濕度90%～95%。每個單元庫內(nèi)分別設(shè)定2組處理：①草酸處理，②對照組(不作處理，僅置于庫內(nèi)低溫存放)。具體處理如下：T1：草酸(1℃±1℃)；T2：CK(1℃±1℃)；T3：草酸(4℃±1℃)；T4：CK(4℃±1℃)；T5：草酸(8℃±1℃)；T6：CK(8℃±1℃)。

隨機從各組抽取桃果測定各種酶活性等作為初始值。貯藏過程中每10d從各組隨機取樣測定一次，直至桃變軟腐爛為止，每種處理3次重復(fù)，取平均值。

1.2.2 酶液制備

各取果肉10～20g，加入適量預(yù)冷的0.05mol/L pH6.4磷酸鹽緩沖液冰浴研磨制成勻漿，于8000r/min離心20min取上清液備用。

1.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

參照高峻鳳[10]的方法，略有改進。鄰苯三酚自氧化法測定SOD酶活力時自氧化產(chǎn)物的吸收峰在325nm。在325nm波長處自反應(yīng)30s，開始每隔30s測定一次吸光度，測4min。計算平均每分鐘吸光度的增量記作ΔA。

1.2.4 丙二醛MDA含量

采用硫代巴比妥酸(TBA)法[11]測定。上清液在532nm和600nm處測定OD值，以0.5% TBA(溶于15% TCA)為參比。按照公式計算丙二醛含量：酶活力/(μmol/g mf)= ΔOD/(155×m)，式中ΔOD是OD532和OD600之差，155為1mmol丙二醛在532nm波長處的消光系數(shù)，m為稱取樣液的質(zhì)量/g。

1.2.5 PPO活力的測定

參照Millar[12]的方法，略有改進。在420nm波長測定OD值在1min內(nèi)的增加量，以煮沸過的酶液做空白。用ΔOD值表示PPO的相對活性，酶活性單位為OD420/ (U/(min·g mf))。

1.2.6 過氧化物酶POD活性

采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定[10]。以1min內(nèi)ΔOD470直接表示POD的相對活性，酶活性單位為OD470/(U/(min· g mf))。

1.2.7 過氧化氫酶CAT的測定

采用紫外吸收法[10]。以磷酸緩沖液做空白對照，用紫外分光光度計在240nm波長處測定光密度，每隔30s讀取OD值，測3min。以1min內(nèi)OD值減少0.01定義為一個活力單位。

過氧化物酶活性/(U/(min·g mf))=ΔOD240×3/0.043 ×106(式中：ΔOD=OD樣－OD空白)

1.2.8 結(jié)果計算

所有測定均重復(fù)3次，取平均值，同時求其標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD活性的變化

圖1 不同溫度條件下草酸對SOD的影響Fig.1 Effect of temperature on SOD activity in peach fruits treated by oxalic acid solution

不同溫度下草酸對SOD的影響情況見圖1，處理組SOD的活性均高于同溫度下的對照組。貯藏期30d時，(1±1)℃處理組是同溫對照組的1.4倍，(4±1)℃處理組比同溫對照組高出42.77%。以草酸(1±1)℃的處理組SOD活性最高。植物組織的抗病和衰老與SOD的活性緊密相關(guān)[13]。SOD活性維持在較高水平下可抑制ACC (乙烯直接前體物)向乙烯的轉(zhuǎn)化，從而平衡桃果實內(nèi)部代謝，增強果實自身免疫性，延緩衰老[14-15]，這說明草酸在(1±1)℃條件下可通過提高SOD的活性來保護桃果實。而(8±1)℃條件下的桃果貯藏效果不好，腐爛快，SOD的活性20d時就降到初始值以下的水平。

2.2 CAT活性的變化

CAT可用來鑒別植物抗性，它的作用是分解H2O2，而H2O2作為一種中間產(chǎn)物參與蛋氨酸生成乙烯的過程，由此可引起乙烯釋放量的增加[1]。草酸的使用基本使3個

溫度條件下的CAT都維持在比對照高的水平。(4±1)℃和(8±1)℃的4組CAT活性均呈下降趨勢，而(1±1)℃的處理組和對照組在貯藏30d時突然達到峰值，此時(1 ±1)℃處理組、對照組分別是(4±1)℃處理組的2.6倍，對照組的3.3倍。可能是貯藏到一定時期H2O2積累到一定程度，從而誘發(fā)草酸在(1±1)℃低溫下發(fā)揮更強的誘導(dǎo)作用，使得該溫度下的桃果實CAT比另兩個溫度更活躍，以此來減緩由過氧化而造成的傷害，尤其是對細胞膜的結(jié)構(gòu)破壞，這可能是CAT含量驟增并維持在較高水平的原因。3個溫度下的桃果在貯藏后期含量均下降到5U/g mf以下。

圖2 不同溫度條件下草酸對CAT的影響Fig.2 Effect of temperature on CAT activity in peach fruits treated by oxalic acid solution

2.3 POD與PPO的變化

圖3 不同溫度條件下草酸對POD的影響Fig.3 Effect of temperature on POD activity in peach fruits treated by oxalic acid solution

由圖3可知，桃果實過氧化物酶POD的活性除(1±1)℃處理組增幅不明顯外其余各組均在貯藏第10天出現(xiàn)了活性高峰。20～60d基本呈下降趨勢，但下降程度平緩。(1±1)℃ 2組分別在50d和60d有再次上升的現(xiàn)象。草酸處理并沒有比對照組抑制POD活性，這與前人研究的結(jié)果不同[13]，如(4±1)℃的處理組POD活性比對照組在貯藏過程中要高出5%～23%，而(1±1)℃在40d時對照組也比處理組要低3%。50d時卻要高出42%，所以可以說草酸對POD活性沒有直接影響。

PPO作為一種防護酶在植物抗病機制中發(fā)揮重要作用。(8±1)℃貯藏的果實PPO活性一直處在較低水平。貯藏20d時對照組已不能檢測出其活性值(用0表示，見圖4)，(1±1)℃和(4±1)℃的桃果實在第20～30天左右時，各組卻都出現(xiàn)活性高峰，這也有可能是因為果實的輕微褐變引起的，PPO在一定程度上反映果肉組織褐變的程度[16]。(4±1)℃的高峰明顯，20d時對照組高達2.433U/g mf，是(1±1)℃的對照組的1.8倍，30d時的處理組是20d (1±1)℃處理組的2.2倍。貯藏后期，草酸使PPO活性均比對照組提高。可能是較低的溫度使PPO活性持續(xù)時間更長，但PPO的影響機制還有待進一步探討。

圖4 不同溫度條件下草酸對 PPO的影響Fig.4 Effect of temperature on PPO activity in peach fruits treated by oxalic acid solution

2.4 MDA的變化

圖5 不同溫度條件下草酸對MDA的影響Fig.5 Effect of temperature on MDA content in peach fruits treated by oxalic acid solution

果蔬在逆境或衰老條件下，細胞膜會發(fā)生過氧化作用，丙二醛是膜脂過氧化作用的重要產(chǎn)物之一[17]，也是逆境生理指標之一。MDA 能強烈地與細胞內(nèi)各種成分發(fā)生反應(yīng)，嚴重損傷酶和膜，使膜電阻及膜的流動性降低，最終導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)及生理完整性破壞，加速果實成熟軟化。從圖5可以看出，桃果的丙二醛含量總的來說是呈逐漸上升趨勢的。仍是以(1±1)℃兩組的抑制效果最好。(4±1)℃和(1±1)℃貯藏的桃果在貯藏中后

期MDA變化較前期更為平緩，草酸對MDA的抑制從20d后開始明顯。以(1±1)℃處理組為例，前期的升幅是后期升幅的1.3倍。但值得一提的是，草酸對MDA的抑制作用不及溫度的抑制作用明顯，貯藏20d時，(8±1)℃對照組是(1±1)℃的1.4倍，(4±1)℃是(1±1)℃的1.2倍，30d時，分別為1.3和1.1倍，到40d時，(4±1)℃對照組是(1±1)℃對照組的1.2倍。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明：與對照組相比，草酸處理能提高SOD、CAT的活性，在貯藏中后期提高PPO的活性，并控制了MDA的積累，但對POD沒有直接影響，以草酸(1±1)℃的處理組效果最為明顯。說明草酸和低溫能在一定程度上提高CA桃果實的抗性相關(guān)酶的活性，對果實抗性生理產(chǎn)生積極作用。

過氧化物酶中的細胞壁結(jié)合部分被認為與抗病密切相關(guān)[18]，它可以催化壁中的大分子物質(zhì)交聯(lián)，修復(fù)受損的細胞壁，還可以通過其他方式積極參與防御反應(yīng)[19-20]。在草酸誘導(dǎo)抗病性中POD沒有發(fā)揮明顯的作用，可能與草酸濃度有關(guān)，也可能是在低溫冷藏條件下，POD扮演抗氧化脅迫的角色，氧化自由基和活性氧，溫度影響了POD的敏感性，提高了果品本身對低溫脅迫的抗性，而草酸的處理反而降低了POD的這種敏感度，減緩了這種作用。這一點與前人[15]的研究結(jié)果相符。

植物誘導(dǎo)抗病性是植物抵御病害侵襲的重要機制之一[21]，對于植物自身免疫、抗氧化能力和細胞保護系統(tǒng)具有相當重要的理論價值和現(xiàn)實意義。能誘導(dǎo)果蔬采后抗性的因子有很多，分生物因子和非生物因子(化學(xué)物質(zhì)、物理因素以及天然物質(zhì)等)。作為化學(xué)誘抗劑的草酸本是生物體的一種代謝產(chǎn)物，在植物誘導(dǎo)抗病中發(fā)揮著重要作用[2]。本實驗中外源草酸的使用與對照組相比，對低溫氣調(diào)貯藏期間的桃果實發(fā)揮了重要的生理調(diào)節(jié)作用，增強了果實抗性，但其誘導(dǎo)強度與溫度有很大關(guān)系，其誘導(dǎo)抗性機理主要涉及到生理生化反應(yīng)，是溫度和草酸的協(xié)同作用還是其他作用還未可知，深入研究可能將為采后生產(chǎn)實踐提供更有力的理論依據(jù)。

本研究僅從防御性酶活性的角度論述了誘導(dǎo)果桃果實采后抗性的因子及其可能的誘導(dǎo)機理，證實了一定濃度的草酸在皮球桃上的誘抗性，但其深入到細胞結(jié)構(gòu)的變化、分子及基因水平上的作用機制還有待于進一步的探索研究。此外，在果蔬保鮮業(yè)上若能把抗性誘導(dǎo)技術(shù)和其他技術(shù)成功結(jié)合，將可能有效提高現(xiàn)有貯藏保鮮技術(shù)水平，在果蔬生產(chǎn)應(yīng)用中也必將具有廣闊的前景。

[1]翟彩霞, 馬春紅, 秦君. 植物誘導(dǎo)抗病性的常規(guī)鑒定相關(guān)酶活性變化與誘導(dǎo)抗病性的關(guān)系[J]. 植物保護科學(xué), 2004, 20(5): 222-224.

[2]GOTTSTEIN H D, KU C J. Induction of systemic resistance to anthracnose in cucumber by phosphates[J]. Phytopathol, 1989, 79: 176-179.

[3]SHIMADA M, AKAMATSU Y, TOKIMATSU T, et al. Possible biochemical roles of oxalic acid as a low molecularweight compound in volved in brown rot and while rot wood decays[J]. Journal of Biotechnology, 1997, 53: 103-113.

[4]ZHENG Guangyu, ZHAO Rongle, PENG Xu. Oxalate induce muskmelon resistance to WMV[J]. Chinese Science Bulletin, 1999, 44: 1059-1062 .

[5]張宗申, 彭新湘, 姜子德, 等. 非生物抗誘劑草酸對黃瓜葉片中過氧化物酶的系統(tǒng)誘導(dǎo)作用[J]. 植物病理學(xué)報, 1998, 28(2): 145-150.

[6]劉毅勝, 周必文, 潘家榮. 油菜對毒素草酸的吸收代謝與抗性機理[J]. 植物病理學(xué)報, 1998, 28(1): 33-37.

[7]YORUK R, BALABANM O, MARSHALLM R, et al. The inhibitory effect of oxalic acid on browning of banana slices[C]. California: Annual Meeting and Food Expo, 2002.

[8]KAYASHIMA T, KATAYAMA T. Oxalic acid is available as a natural antioxidant in some systems[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2002, 1573: 1-3.

[9]鄭小林, 田世平, 李博強. 草酸對冷藏期間桃果實抗氧化系統(tǒng)和PPO活性的影響[J]. 園藝學(xué)報, 2005, 32(5): 788-792.

[10]高俊鳳. 植物生理學(xué)實驗技術(shù)[M]. 西安: 世界圖書出版公司, 2000.

[11]劉萍, 李明軍. 植物生理學(xué)實驗技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2007: 123-125.

[12]MILLAR A H, DAY D A. Nitric oxide inhibits the cytochrome oxidase but not the alternative oxide of plant mitochondria[J]. FEBS Lett,1996, 398(2/3): 155-158.

[13]魏文毅, 王貴禧, 梁麗松, 等.‘八月脆’桃果實氣調(diào)貯藏過程中品質(zhì)及相關(guān)酶活性的變化[J]. 林業(yè)科學(xué), 2008, 44(3): 82-86.

[14]熊興淼, 饒景萍, 戴思琴. 冷激處理對油桃貯藏品質(zhì)和抗氧化酶活性的影響[J]. 西北植物學(xué)報, 2006, 26(3): 473- 477.

[15]郭國寧, 楊英軍, 楚愛香, 等. 三種保鮮劑對“玉西紅蜜”桃貯藏品質(zhì)的影響[J]. 北方園藝, 2008(10): 194-196.

[16]周濤, 許時嬰, 王璋, 等. 熱激處理及貯藏溫度對水蜜桃果實生理生化變化的影響[J]. 中國南方果樹, 2003, 32(2): 39-44.

[17]LIGGE R L, THOMPSON J E, BBKER J E. Free radical-mediated formation of ethylene from 1-anino-eyclopropare-1-carboxy licacid: A Spintray[J]. Study Plant Cell physiol, 1982, 23: 171-177.

[18]FILEDING J L, HALL J L. A biochemical and cytochemical study of peroxidase activity in roots of Pisum sativum[J]. J Exp Bot, 1978, 29: 969-981.

[19]李雄彪. 植物細胞壁[M]. 北京: 北京大學(xué)出版社, 1993: 87-89.

[20]闋求登. 植物初生壁的非纖維素多糖及其生理功能[J]. 植物生理學(xué)通訊, 1988, 24(6): 6-9.

[21]王燕華, 何水林. 植物誘導(dǎo)抗病性的分子生物學(xué)研究進展[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2004, 10(6): 811-815.

Induction of Enzyme Activity in Peach with Oxalic Acid Treatment during Storage

ZHANG Kuo1，QIN Wen1,*， LI Zheng-guo2， PENG Chun-hua3
(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China；2. College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China；3. Longquanyi Fruit Research Institute, Chendu 323700, China)

The peach ball peach fruits were treated with oxalic acid solution after harvest and then placed in atmospherecontrolled cold storage at the conditions of (1 ± 1), (4 ± 1) ℃ and (8 ± 1) ℃. The activities of resistant enzymes and the content of malondialdehye (MDA) during atmosphere-controlled storage were determined to explore the effects of oxalic acid and temperature on resistant physiology of postharvest peach fruits. Compared with the control group, oxalic acid solution could improve the activities of SOD and CAT, and improve the activity of PPO in the mid and late period of storage as well. However, oxalic acid treatment did not exhibit direct influence on POD activity and decrease the content of MDA in postharvest peach fruits during storage. The most obvious effect of oxalic acid treatment at (1 ± 1) ℃ on peach fruits was observed. Therefore, oxalic acid treatment and low temperature storage can enhance the resistance of peach fruits to a certain degree.

oxalic acid；resistance；enzyme activity；temperature

S789.5

A

1002-6630(2010)22-0492-04

2010-06-30

成都市科技攻關(guān)計劃項目(10GGYB208NC-182)

張闊(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為果蔬采后生理及貯藏。E-mail：water862@126.com

*通信作者：秦文(1967—)，女，教授，博士后，研究方向為果蔬貯藏保鮮技術(shù)。E-mail：qinwen1967@yahoo.com.cn