氣相色譜-質(zhì)譜法分離鑒別溪黃草葉中的弱極性有機(jī)組分

林戀竹，趙謀明*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

氣相色譜-質(zhì)譜法分離鑒別溪黃草葉中的弱極性有機(jī)組分

林戀竹，趙謀明*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

利用氣相色譜-質(zhì)譜法分析石油醚相及乙酸乙酯相中弱極性有機(jī)組分是否含有與抗氧化性有關(guān)的化合物。通過制備溪黃草葉60%乙醇提取物，并采用溶劑分離法，從溪黃草葉提取物中分出4個(gè)組分：石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相。氣相色譜-質(zhì)譜法共鑒定出15種成分，其中大多數(shù)為高級(jí)脂肪酸，尤其以棕櫚酸、亞麻酸甲酯含量最為豐富。雖從溪黃草葉石油醚相中鑒定出2,2'-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)(工業(yè)強(qiáng)抗氧化劑)，但其含量很低。

氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)；溪黃草葉；弱極性有機(jī)成分；抗氧化

溪黃草屬于唇形科香茶屬植物，是一種多年生草本植物。溪黃草具有清熱祛濕、涼血散瘀之功效。對(duì)急性肝炎、腸炎、痢疾等有較好效果[1]。溪黃草含萜類[2]、黃酮類[3-4]等多種化學(xué)成分。其中，黃酮類化合物因其良好的抗氧化性受到廣泛關(guān)注。通過制備溪黃草葉60%乙醇提取物，并采用溶劑分離法，從溪黃草葉提取物中分出4個(gè)組分：石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相。按照活性追蹤的思路分離具有良好抗氧化性的化合物需要評(píng)價(jià)每個(gè)組分的抗氧化性。

國際上通用的抗氧化測(cè)定方法包括：ORAC法、DPPH自由基法、ABTS+·法、FRAP法[5-7]，這些方法只適用于極性較大的物質(zhì)，因?yàn)镈PPH自由基法用乙醇做反應(yīng)體系[8]，F(xiàn)RAP法[9]為水相體系，ABTS+·法可用乙醇或水做反應(yīng)體系[10]。雖然Prior等[11]改良ORAC法，使其適用于脂溶性物質(zhì)抗氧化的評(píng)價(jià)，但也是建立于此物質(zhì)溶于丙酮，而丙酮可與7%甲基化環(huán)糊精水溶液混溶的基礎(chǔ)上。但極性很弱的物質(zhì)(特別是混合物)不一定能溶于丙酮或乙醇中，特別是測(cè)定濃度要求相對(duì)較高時(shí)。因此，還找不到一個(gè)很好的方法評(píng)定弱極性有機(jī)物質(zhì)的抗氧化性。但可以利用快速、高效的氣相

色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)研究其化學(xué)成分，從而推知其抗氧化性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

溪黃草：2009年9月12日采于廣東省羅浮山，經(jīng)中國科學(xué)院華南植物園葉華谷研究員鑒定為溪黃草。

乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、碘、冰乙酸、乙醚、氯仿(均為分析純)；層析用200～300目硅膠、薄層層析硅膠板GF254 青島海洋化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；ZF-C三用紫外分析儀 上海滬西儀器分析廠；GC6890NMSD5973N聯(lián)用儀、HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(30m× 0.25mm，0.25μm) 美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

摘除新鮮溪黃草爛葉，用清水洗凈污漬，采用自然晾曬干燥，將莖、葉分離。用中藥粉碎機(jī)粉碎溪黃草葉，過6 0目篩，保存于干燥器中。

1.3.2 溪黃草葉抗氧化成分提取

溪黃草干葉0.72kg，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇15L加熱回流提取2次，每次2 h，離心，過濾，取上清液，即得。

1.3.3 溪黃草葉弱極性有機(jī)成分分離

55℃減壓除去上清液中乙醇，直至濃縮液無醇味。濃縮后的液體用量筒量取體積，依次用3倍體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取。減壓回收各相溶劑。

細(xì)分石油醚相：將石油醚相上硅膠(100g)柱(濕法上柱)，石油醚-乙酸乙酯(100:0～0:100，V/V)梯度洗脫，每20mL收集一管。點(diǎn)薄層層析板，以石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸(70:30:4，V/V)做展開劑，用紫外燈及碘蒸氣檢查展開情況，將展開Rf值相似的組分合并，并減壓回收溶劑。

粗分乙酸乙酯相：將乙酸乙酯相上硅膠(500g)柱(干法上柱)，依次用石油醚-乙酸乙酯(80:20～0:100)及乙酸乙酯-甲醇(100:0～0:100)梯度洗脫。每500mL 收集一個(gè)組分。點(diǎn)薄層層析板，以石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸(70: 30:4)做展開劑，用紫外燈及碘蒸氣檢查展開情況，將展開Rf值相似的組分合并，并減壓回收溶劑。

1.3.4 GC-MS分析樣液制備

分別稱取各組分5mg，分別溶于1mL乙醚中(若不溶于乙醚，則改為氯仿溶解)，混合均勻，過0.45μm有機(jī)膜。

1.3.5 弱極性有機(jī)成分分析

氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度280℃；載氣為99.999%高純氦氣；載氣流量1mL/min；彈性石英毛細(xì)管柱(30m ×0.25mm，0.25μm)；程序升溫；150℃維持3min，以10℃/min的速度升溫至280℃，并于280℃維持5min；進(jìn)樣量為0.2μL。

質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度為230℃；四極桿溫度為150℃：離子源電離源為70eV，接口溫度為280℃，美國NIST 05譜庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 溪黃草葉弱極性有機(jī)成分分離

55℃減壓回收石油醚，得石油醚相(深黃綠色黏稠液體)1.5g，55℃減壓回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯相(深黃綠色膏體)40.1g。

共收集石油醚相洗脫組分300管，點(diǎn)薄層板合并相似組分，得到：組分62～65(白色蠟狀固體)：60mg；組分66～90(淡黃色膏體)：660mg；組分91～102(褐色膏體)：37mg；組分120～125(淡綠色粉末)：9mg；組分204～215(無色晶體)：100mg。

共收集乙酸乙酯相洗脫組分62份，點(diǎn)薄層板合并相似組分，得到弱極性有機(jī)組分：組分1(棕紅色油狀液體)：340mg；組分3(褐色膏體)：490mg。

2.2 GC-MS分析結(jié)果

采用硅膠柱層析，分離純化石油醚相及乙酸乙酯相，得到7個(gè)弱極性有機(jī)組分，經(jīng)GC-MS檢測(cè)，與NIST05L質(zhì)譜圖庫中的標(biāo)準(zhǔn)圖對(duì)照，按峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析。弱極性有機(jī)組分GC-MS分析結(jié)果見表1。

由表1可知，共鑒定出15種成分。其中大多數(shù)為高級(jí)脂肪酸，尤其以棕櫚酸、亞麻酸甲酯含量最為豐富。其次，亞油酸及硬脂酸含量也比較高。此外，角鯊烯也占據(jù)不少比例。這些脂肪酸雖具有重要的生理功能[12-13]，但不具抗氧化性。不飽和脂肪酸含單個(gè)或若干個(gè)雙鍵，雙鍵旁的α-H相對(duì)活潑，因此不飽和脂肪酸較易失去H質(zhì)子，自身變?yōu)橐环N自由基。不飽和脂肪酸缺少大共軛結(jié)構(gòu)，失去H質(zhì)子后所形成的自由基不穩(wěn)定，反而會(huì)引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，生成有害的過氧化物。因此不飽和脂肪酸非但不具抗氧化性，反而是一種助氧化劑。盡管如此，從溪黃草葉石油醚相中鑒定出2,2'-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)，這是一種工業(yè)上的通用型強(qiáng)力雙酚類抗氧劑，廣泛應(yīng)用于天然橡膠、各種合成橡膠、聚乙烯、聚丙烯、聚甲醛、A B S樹脂、氯化聚醚、聚氨酯等多種合成材料[14-15]，但其含量在溪黃草是微量的。

氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)適用于分離、分析鑒定揮發(fā)性較高的復(fù)雜組分，因此，利用GC-MS研究溪黃草葉提取物中弱極性有機(jī)組分的化學(xué)成分是一種快速，高效的方法。通過GC-MS分析，鑒定出溪黃草葉弱極性有機(jī)組分中相對(duì)含量較高的化合物。溪黃草葉弱極性有機(jī)組分復(fù)雜，雖經(jīng)過硅膠柱分離純化，但某些組分中部分化合物的質(zhì)譜圖無法與標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫中的質(zhì)譜圖相匹配，因此不能由氣相色譜-質(zhì)譜法鑒定出來，這也是氣相色譜-質(zhì)譜法的局限性所在。其中未鑒定組分還需要進(jìn)一步分離純化得到單體，輔之以核磁共振等現(xiàn)代儀器分析方法，得到準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)信息。

表1 弱極性有機(jī)組分的GC-MS分析Table1 GC-MS analysis of organic weak polar components in Rabdosia serra (Maxim.) Hara leaves

3 結(jié) 論

通過制備溪黃草葉60%乙醇提取物，采用有機(jī)溶劑分級(jí)，得到石油醚相及乙酸乙酯相。采用硅膠柱層析，分離純化石油醚相及乙酸乙酯相，得到7個(gè)弱極性有機(jī)組分，采用GC-MS分析鑒定，共鑒定出15種成分。其中大多數(shù)為高級(jí)脂肪酸，尤其以棕櫚酸、亞麻酸甲酯含量最為豐富。雖從溪黃草葉石油醚相中鑒定出2,2'-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)(工業(yè)上強(qiáng)抗氧化劑)，但其含量很低。未鑒定組分還需要進(jìn)一步分離純化得到單體，輔之以核磁共振等現(xiàn)代儀器分析方法，得到準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)信息。

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì). 中國植物志[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1977: 433-434.

[2]CHEN Xiao, LIAO Renan, XIE Qinglan. Abietane diterpenes from Rabdosia serra (Maxim) hara[J]. Journal of Chemical Researchs, 2001, 4: 148-149.

[3]丁利君, 周燕芳, 林楠. 溪黃草中黃酮類物質(zhì)提取及對(duì)羥自由基清除作用[J]. 食品與機(jī)械, 2004, 20(3): 13-14.

[4]樓小紅. 溪黃草根莖葉不同部位總黃酮的含量測(cè)定[J]. 中國醫(yī)藥學(xué)報(bào), 2004, 19(5): 316-317.

[5]OU B, MAUREEN H W, PRIOR R L. Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(10): 4619-4626.

[6]PRIOR R L, WU X L, SCHAICH K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53 (10): 4290-4302.

[7]HUANG D J, OU B, PRIOR R L. The chemistry behind antioxidant capacity assays[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(6): 1841-1856.

[8]LUO Wei, ZhAO Mouming, YANG Bao, et al. Identification of bioactive compounds in Phyllenthus emblica L. fruit and their free radical scavenging activities[J]. Food Chemistry, 2009, 114: 499-504.

[9]OU B, HUANG D J, MAUREEN H W, et al. Analysis of antioxidant activities of common vegetables employing oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays: a comparative study[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(11): 3122-3128.

[10]RE R, PELLEGRINI N, PROTEGGENTE A, et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radical Biology and Medicine,1999, 26: 1231-1237.

[11]PRIOR R L, HOANG H, GU L W, et al. Assays for hydrophilic and lipophilic antioxidant capacity (oxygen radical absorbance capacity (ORACFL)) of plasma and other biological and food samples[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(11): 3273-3279.

[12]回瑞華, 侯冬巖, 李鐵純, 等. 板栗中脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜分析[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(8): 541-542.

[13]廖杰, 趙玉蘭, 李寧, 等. 植物油中角鯊烯的GC/MS分析[J]. 現(xiàn)代儀器, 2008(5): 36-37.

[14]張鳳軍, 張樹繼. 抗氧劑的研究與發(fā)展現(xiàn)狀[J]. 煉油與化工, 2008, 19(3): 7-10.

[15]李德忠, 劉慶民. 酚類抗氧劑在聚合物中的應(yīng)用[J]. 科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào), 2008(18): 17-19.

Gas Chromatography - Mass Spectrometry Separation and Identification of Organic Weak Polar Components from Rabdosia serra (Maxim.) Hara Leaves

LIN Lian-zhu， ZHAO Mou-ming*
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Rabdosia serra (Maxim.) Hara leaves were extracted with 60% ethanol, and were further separated by solvent extraction into four fractions, i.e., petroleum ether fraction, ethyl acetate fraction, n-butanol fraction and water fraction. Components in petroleum ether and ethyl acetate fractions were analyzed by using gas chromatography-mass spectrometry. Totally 15 compounds were identified, and most of these compounds are higher fatty acids, especially n-hexadecanoic acid and 9,12,15-octadecatrienoic acid. Trace 2,2'-methylene bis(6-tert-butyl-4-methylphenol), a strong antioxidant, was found in the petroleum ether fraction.

gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)；Rabdosia serra (Maxim.) Hara leaves；extract；weak polar components；antioxidant

TS201.2

A

1002-6630(2010)22-0340-03

2010-01-31

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA100404)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008A010900003)

林戀竹(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：linlinlin137@sina.com

*通信作者：趙謀明(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：femmzhao@scut.edu.cn