響應(yīng)曲面法優(yōu)化紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工藝

宋婉睿，聶少平，胡曉鵑，高麗英，邱奇琦，李 昌，謝明勇*

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工藝

宋婉睿，聶少平，胡曉鵑，高麗英，邱奇琦，李 昌，謝明勇*

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

采用響應(yīng)曲面法對(duì)紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，建立影響香豆雌酚粗提取物得率的3個(gè)主要因素即液料比、提取溫度和提取時(shí)間與提取率之間的數(shù)學(xué)模型。利用SAS V8.0軟件分析表明：在液料比27.28:1(mL/g)、提取溫度67.7℃和提取時(shí)間13.77h時(shí)，香豆雌酚粗提取物得率較高，最佳提取率為2.64‰，與預(yù)測(cè)值基本相符。

紫花苜蓿；香豆雌酚；提取；響應(yīng)曲面法

香豆雌酚(coumestrol)，又名考邁斯托醇、擬雌內(nèi)酯，是一種含雌激素活性的晶狀化合物，最初被提取于白三葉草中，因其結(jié)構(gòu)與當(dāng)時(shí)已發(fā)現(xiàn)的異黃酮類(lèi)植物雌激素不同，而是一種香豆素衍生物，故被命名為香豆雌酚[1]。研究表明：香豆雌酚為苯并呋喃并香豆素，單一成分，是一種主要存在于紫花苜蓿等豆科植物的具有擬雌激素作用和抗雌激素作用的天然活性物質(zhì)[2]。現(xiàn)代研究已證實(shí)植物雌激素對(duì)女性絕經(jīng)綜合癥[3]、心血管疾病[4]、癌癥[5]、骨質(zhì)疏松[6]及生殖系統(tǒng)[7]等都具有較好的調(diào)節(jié)作用，且其中的一些功能也已在香豆雌酚的研究中得到證實(shí)[8-10]，但由于其許多方面尚處于研究階段，還未廣泛地應(yīng)用到制藥和保健品等領(lǐng)域。

近年來(lái)，對(duì)于香豆雌酚的研究已逐漸受到重視，但大多集中在香豆雌酚的檢測(cè)及生物活性方面[11-14]，有關(guān)香豆雌酚的提取卻很少提及。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇回流浸提的方法對(duì)紫花苜蓿中的香豆雌酚進(jìn)行粗提取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法(response surface methodology，RSM)[15-16]對(duì)溫度、時(shí)間、液料比3個(gè)主要影響香豆雌酚粗品提取率的因素進(jìn)行優(yōu)化，探索紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取的最佳工藝，為香豆雌酚的提取提供新的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

去脂的紫花苜蓿干粉：紫花苜蓿干草(浙江)粉碎過(guò)40目篩，索氏除脂后干燥備用。

香豆雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%以上) Sigma公司；甲醇、石油醚(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1104電子天平 上海精天電子儀器廠；TU-1990雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；SHZIIIB循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化有限公司；DFY-500粉碎機(jī) 溫嶺市大海藥材器械廠；索氏抽提器 上海精密儀器有限公司；DGG-9140B電熱鼓風(fēng)干燥箱、D2G-6050真空干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香豆雌酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱(chēng)取香豆雌酚標(biāo)準(zhǔn)品5.5mg，用少量甲醇溶解后置于100mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成55mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成2.75、5.5、8.25、11、13.75、16.5mg/L的香豆雌酚甲醇溶液，于波長(zhǎng)343nm處測(cè)定吸光度[1]，另取甲醇溶液作為空白對(duì)照。以香豆雌酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制香豆雌酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品中香豆雌酚粗品的單因素提取及含量的測(cè)定

稱(chēng)取去脂的紫花苜蓿干粉2.00g，放入250mL燒瓶中，按一定的液料比加100%甲醇溶液，在一定溫度下提取一定時(shí)間，冷卻，過(guò)濾。濾液于100mL容量瓶定容，精密吸取樣品液1mL，置10mL容量瓶中定容測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物的含量。

1.3.3 紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的計(jì)算

1.3.4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table1 Factors and levels of response surface experiments

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取3個(gè)主要影響紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的因素即液料比(mL/g)、提取溫度/℃以及提取時(shí)間/h，采用三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)及分析方法對(duì)紫花苜蓿中香豆雌酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 香豆雌酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

香豆雌酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為C=0.09533A＋0.00571，R2=0.9997，線性良好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 液料比對(duì)香豆雌酚提取的影響

在提取時(shí)間3h、提取溫度50℃條件，研究7種不同液料比對(duì)紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的影響，分別為10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1 (mL/g)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 液料比對(duì)香豆雌酚粗提取物得率的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

由圖1可知，液料比的變化對(duì)紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物的得率有較大的影響。隨著液料比的增加，香豆雌酚粗提取物的得率先增加后降低，在液料比為25:1時(shí)得率達(dá)到最高。此結(jié)果與多數(shù)酚類(lèi)研究類(lèi)似[17]。

2.2.2 提取溫度對(duì)香豆雌酚提取的影響

圖2 提取溫度對(duì)香豆雌酚粗提取物得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

在液料比25:1(mL/g)、提取時(shí)間3h條件下，設(shè)定30、40、50、60、65、70℃ 6個(gè)溫度，研究提取溫度對(duì)紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的影響。結(jié)果如圖2所示，隨著溫度的提高紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率增加顯著，在65℃時(shí)達(dá)到最大，隨后得率有所下降，可能由于過(guò)度高溫破壞了香豆雌酚的結(jié)構(gòu)。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)香豆雌酚提取的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)香豆雌酚粗提取物得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

在液料比25:1(mL/g)、提取溫度50℃條件，設(shè)定3、6、9、12、15、17、19h 7個(gè)提取時(shí)間，研究提取時(shí)間對(duì)紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的影響。結(jié)果如圖3所示，隨著時(shí)間的增加紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率增加顯著，在12～17h之間呈現(xiàn)平穩(wěn)，隨后得率有所下降，可能由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，香豆雌酚受到了破壞。

2.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)分析與優(yōu)化

2.3.1 試驗(yàn)結(jié)果與模型建立

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Design and results of orthogonal experiments for the extraction of crude coumestrol from Alfalfa

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，利用SAS V8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到香豆雌酚粗提取物得率對(duì)以上3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型為：

2.3.2 方差分析

表3 回歸方程方差分析Table3 Variance analysis for regression equation

利用SAS Rsreg程序?qū)Ρ?數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析(表3、4)。結(jié)果表明，以紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率為響應(yīng)值所建立的回歸模型具有高度的顯著性。方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交叉項(xiàng)和總回歸的影響都顯著，并且一次項(xiàng)中X1、X2極顯著，X3顯著，而二次項(xiàng)中X22極顯著，X1X2和X2X3次之，表明各因素對(duì)紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的影響都不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表4 回歸方程偏回歸系數(shù)的估計(jì)值Table4 Estimated value of partial regression coefficients for regression equation

從表4可見(jiàn)，方程的決定系數(shù)為97.26%，R2Adj= 92.32%，由此可知，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值即紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率之間的關(guān)系時(shí)，其因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著，其回歸方程的擬合程度和可信度均較高，能夠很好地對(duì)紫花苜蓿香豆雌酚粗提取物得率進(jìn)行很好的預(yù)測(cè)。且由表4中P值可知，各因素影響程度從大到小為液固比、提取溫度和提取時(shí)間。

2.3.3 響應(yīng)曲面分析

利用SAS軟件的Rsreg程序進(jìn)行典型分析，得到各因素的最優(yōu)值的代碼值X1=0.455219、X2=0.532936、X3=－0.617042，換算后得出相應(yīng)的實(shí)際值為液料比27.28:1 (mL/g)、浸提溫度67.7℃、提取時(shí)間13.77h，此時(shí)紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率理論值Y=2.62‰。

圖4 液料比(X1)與提取溫度(X2)對(duì)紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between material-liquid ratio and extraction temperature on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

圖5 液料比(X1)與提取時(shí)間(X3)對(duì)紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between material-liquid ratio and extraction time on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

圖6 提取時(shí)間(X3)與提取溫度(X2)對(duì)紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction time and extraction temperature on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

2.3.4 回歸模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，實(shí)際測(cè)得的紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物的平均得率為2.64‰，實(shí)驗(yàn)值與理論值的相對(duì)誤差為0.76%，證明應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化紫花苜蓿中香豆雌酚提取工藝的可行性較高。

3 結(jié) 論

研究表明：采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工藝，其香豆雌酚粗提取物的得率在液料比27.28:1(mL/g)、提取溫度67.7℃、提取時(shí)間13.77h時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率為2.64‰，與預(yù)測(cè)值2.62‰的相對(duì)誤差為0.76%。

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Optimal Extraction of Coumestrol from Alfalfa by Response Surface Methodology

SONG Wan-rui，NIE Shao-ping，HU Xiao-juan，GAO Li-ying，QIU Qi-qi，LI Chang，XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The extraction processing of coumestrol from Alfalfa was optimized by response surface methodology (RSM). On the basis of single-factor experiments, a mathematical regression model was established for predicting between extraction rate of crude coumestrol and three critical extraction factors including material-liquid ratio, extraction temperature and extraction time. The optimal extraction processing parameters were material-liquid ratio of 27.28:1 (mL/g), extraction temperature of 67.7 ℃ and extraction time of 13.77 h. Under these optimal conditions, the actual extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa was 2.64‰, which was well consistent with the predicted value. These results can provide a theoretical reference for the extraction of coumestrol from Alfalfa.

Alfalfa；coumestrol；extraction；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2010)22-0242-05

2010-06-28

南昌大學(xué)國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2010DFA31780)

宋婉睿(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：ojecar2000@126.com

*通信作者：謝明勇(1957—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與分析、食品營(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：myxie@ncu.edu.cn