基于超濾法從牛初乳中分離胰島素樣生長因子-Ⅰ的工藝條件

郭 洪，陳慶森*，閆亞麗

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

基于超濾法從牛初乳中分離胰島素樣生長因子-Ⅰ的工藝條件

郭 洪，陳慶森*，閆亞麗

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

利用超濾技術從牛初乳中分離IGF-Ⅰ，并對脫脂和超濾條件進行優化。IGF-Ⅰ的質量濃度檢測采用放射免疫法測定，總蛋白質量濃度采用考馬斯亮藍法測定。結果表明：牛初乳中分離IGF-Ⅰ過程中制備脫脂乳最適工藝條件為36℃、4000r/min離心15min；經截留分子質量為10～20kD的中空纖維膜超濾除雜蛋白和6kD的中空纖維膜超濾去除乳糖等小分子物質，所得的IGF-Ⅰ的純度濃度較初乳中提高了約3660倍。本方法確立了從牛初乳中分離純化較高純度IGF-Ⅰ的技術路線。

牛初乳；胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)；脫脂；超濾法；工藝條件

胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-Ⅰ，簡稱IGF-Ⅰ)與胰島素有相似的結構，且與胰島素享有70%的同源性，是一類具有細胞分化和增殖功能，并具有胰島素樣作用的多肽[1-2]，因此，被命名為胰島素樣生長因子。其分子質量為7649D，等電點是8.4[3]。IGF-Ⅰ在細胞分化、動物生長發育、繁殖、代謝等方面發揮著廣泛的作用，特別是通過刺激腸道上皮的生長繁殖，維護由腸道黏膜上皮層及附著于表面的黏液層構成的腸道機械屏障功能，從而對胃腸道黏膜自身穩態和傷口愈合起重要作用[4]。它除了在組織細胞存在外，在牛的初乳中大量存在[5-9]。牛初乳來源廣泛，從牛初乳中提取IGF-Ⅰ可實現資源利用和提高附加值的目的。牛初乳是指奶牛分娩后7d內特別是3d內所分泌的乳汁。國內外許多研究表明因采集牛初乳的時間等條件存在著較大差異，報道的IGF-Ⅰ的質量濃度多在50～200μg/L之間，而常乳IGF-Ⅰ的質量濃度不足10μg/L[10-12]。

目前國內外分離牛初乳中IGF-Ⅰ的主要方法是凝膠過濾層析法和離子交換層析法，存在耗時長、成本較為昂貴的缺點。進入20世紀90年代，超濾技術被引入到IGF-Ⅰ的研究中，該法節省人力、物力和時間[13-14]。

本研究主要對初乳脫脂以及利用中空纖維膜超濾技術純化IGF-Ⅰ的條件進行研究，擬建立并確立中試規模生產IGF-Ⅰ的技術路線及相關參數，為牛初乳的進一步開發利用提供有益探索。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛初乳 天津海河乳業有限公司奶源基地；木瓜凝乳酶 廣西南寧龐博生物有限公司；IGF-Ⅰ放射免疫試劑盒 天津九鼎生物有限公司；考馬斯亮蘭試劑 Sigma公司。

中空纖維膜組件(截留分子質量60～80kD，截留分子質量10～20kD，截留分子質量6kD 天津膜天膜生物技術有限公司)；FD-1型冷凍干燥機 鄭州長城科工貿有限公司；RE52-05旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；79.3型磁力恒溫攪拌器 常州國華電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海益恒實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 初乳脫脂工藝方法[6]

將初乳經多層紗布真空抽濾，除掉肉眼可見的雜質，制得預處理的初乳。制備脫脂初乳分別考察離心轉速、時間、溫度等不同參數，并進行條件優化，通過測定初乳及脫脂乳中的脂肪含量，計算脫脂率。同時測定每步中IGF-Ⅰ的質量濃度及總蛋白濃度，篩選出最適制備脫脂初乳的工藝條件。

1.2.2 制備IGF-Ⅰ粗提物的參數條件[15]

1.2.2.1 乳清制備

新鮮配制10%(m/V)的木瓜凝乳酶溶液，預熱至36℃，按酶液:脫脂初乳為1:50(V/V)的量緩緩加入脫脂初乳液(36℃，HCl溶液調pH6.0)中，充分混合均勻，靜置40min使之凝結。攪拌使凝乳破碎釋放乳清，離心(3000r/min，15min)去凝結蛋白，得初乳乳清。

1.2.2.2 去除IGF-Ⅰ結合蛋白

將制得的初乳乳清低溫冷卻后與同樣低溫冷卻的酸醇溶液(2mol/L HCl溶液:無水乙醇為1:7)混合，略加攪拌，4℃條件下靜置30min，去除IGF-Ⅰ結合蛋白。其中初乳乳清:酸醇溶液為1:4(V/V)。

1.2.2.3 減壓濃縮

在44℃條件下進行旋轉蒸發至原溶液的1/3～1/4，將濃縮液調pH6.5，以除掉乙醇和HCl。離心(3000r/min，15min)取得上清液，作為超濾的前處理物。

1.2.2.460 ～80kD中空纖維超濾膜超濾

使用60～80kD超濾膜的參數條件設定為24℃、pH6.5、操作壓力0.06MPa，目的是除掉大分子質量雜蛋白。

經過以上步驟后可制得IGF-Ⅰ粗提物。

1.2.3 初乳IGF-Ⅰ精制備的參數條件確定[15]

對IGF-Ⅰ的兩步純化均使用中空纖維超濾膜，截留分子質量分別為10～20kD和6kD的超濾膜，兩步操作均設計了壓力、溫度、pH值的3個參數條件的優化。

1.2.3.1 10～20kD膜超濾

參數分別為溫度(4、20、36℃)、壓力(0.04、0.06、0.08MPa)、pH值(4.5、5.5、6.5)，為使提取損失減少，采用1000mL粗提液與2200mL純水混合，取得3000mL濾出液的比例進行。

1.2.3.2 6kD膜超濾

參數分別為溫度(4、20、36℃)、壓力(0.04、0.06、0.08MPa)、pH值(6.0、7.0、8.0)，為盡可能除去乳糖和礦物質等雜質，采用1000mL一步純化產物和2200mL純水混合，取得400mL濃縮液的比例進行。

1.2.4 IGF-Ⅰ質量濃度及總蛋白濃度測定[15]

IGF-Ⅰ質量濃度測定：采用放射免疫法，利用放射免疫試劑盒通過γ-計數器進行檢測[7]；各步中的總蛋白質量濃度采用考馬斯亮蘭法測定。在條件優化過程中，溶液體積以及蛋白含量均發生變化，故引入“相對濃度”來考察，即：

1.2.5 脂肪含量測定

參照GB/T 5409—85《牛乳檢驗方法》的方法即哥特里-羅茲法進行[16]。

2 結果與分析

2.1 牛初乳脫脂工藝的確定

只能這樣了，何良諸繞到車那面，蹲在踏板上，小勺沒有發現。就是看見了，車門外掛大肉，也不是司機買的。卡車起動，加速，寒風呼嘯，出街口后，道路孬，車沒命地顛簸，何良諸摳車門的手，凍得粘住了，挺起脖子，看見趙集直勾勾前視，嘴角掛著暖和的笑。何良諸憤怒了，這家伙，怎么會笑！車沒有停下的意思，叫車豁子涮了！何良諸又急又恨，心里明白，卻不敢亂動，舉了幾次，終于把凍僵的手像棍子似豎起來，梆梆梆敲玻璃。趙集嚇了一跳，才想起門外掛塊肉，急煞車。趙集扭身推車門，何良諸蹲在踏板上。趙集貼住車窗，叫嚷：“下去。”

從牛初乳中提取IGF-Ⅰ，首先是通過離心方法脫脂，因脂肪的存在直接影響IGF-Ⅰ的含量及穩定性。此外，脫脂還可以防止脂肪氧化產生不良風味，提高初乳流動性。在離心脫脂過程中，會有總蛋白及IGF-Ⅰ的損失，所以在離心轉速、時間及溫度等操作參數影響初乳中脂肪的脫除，本研究將初乳乳脂的脫除率和IGF-Ⅰ的損失率綜合考慮，以保證乳脂肪盡量脫除的前提下，最大限度保留IGF-Ⅰ。因此考察離心轉速、時間及溫度對IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度及含脂率的影響。

2.1.1 離心轉速對IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度及脫脂率的影響

表1 離心轉速對IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度及脫脂率的影響Table1 Effect of centrifugation speed on the content of IGF-I, total protein and degreasing rate

由表1看出，隨著離心轉速的增加，IGF-Ⅰ和總蛋白的質量濃度均略有減少，脫脂率顯著增高，而IGF-Ⅰ的相對濃度有所增加，為達到脫脂率較高，而IGF-Ⅰ損失相對較小的目標，故選定4000r/min為最適離心轉速。

2.1.2 離心時間對IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度及脫脂率的影響

表2 離心時間對IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度及脫脂率的影響Table2 Effect of centrifugation time on the content of IGF-Ⅰ, total protein and degreasing rate

由表2可見，隨著離心時間的增加，蛋白發生沉淀，IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度減少，IG-Ⅰ相對濃度增加。在保證脫脂率的前提下，而減少IGF-Ⅰ的損失，故采用離心15min 為最適離心時間。

2.1.3 離心溫度對IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度及脫脂率的影響

表3 離心溫度對IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度及脫脂率的影響Table3 Effect of centrifugation temperature on the content of IGF-Ⅰand total protein and degreasing rate

從表3可以看出，隨著離心溫度的升高，初乳的黏度下降，流動性增加，IGF-Ⅰ的質量濃度和相對濃度均有所增加，含脂率大幅降低，因此選定36℃為最適離心溫度。

2.2 IGF-Ⅰ前處理過程中IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度的變化

依據1.2.2節所確立的方法及參數條件，試驗所得各項結果見表4。

表4 前處理操作對IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度的影響Table4 Effect of pretreatment methods on the content of IGF-Ⅰand total protein

由表4可得，由于對牛初乳所進行的前處理過程中酸醇去結合蛋白，旋蒸濃縮及超濾操作造成的溶液體積及料液濃度變化，IGF-Ⅰ及總蛋白質量濃度有所波動，但IGF-Ⅰ的相對濃度則急劇增加，比初乳中IGF-Ⅰ的質量濃度增加796倍，說明這些前處理操作對獲取高品質的IGF-Ⅰ是有效的，這將為后續的IGF-Ⅰ純化提供了基礎。

2.3 超濾條件對制備高純度IGF-Ⅰ的影響

2.3.110 ～20kD超濾純化IGF-Ⅰ的研究結果

經過1.2.2節的方法得到的IGF-Ⅰ粗提物已除掉了大部分的雜蛋白，使IGF-Ⅰ的相對濃度顯著提高。根據IGF-Ⅰ的分子質量研究選擇10～20kD的超濾膜，進一步除雜蛋白，對該超濾分離條件進行了研究。結果見表5～7。

表5 超濾pH值對IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度的影響Table5 Effect of pH during ultra-filtration with 10－12 kD membrane on the content of IGF-Ⅰand total protein

表6 超濾溫度對IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度的影響Table6 Effect of temperature during ultra-filtration with 10－12 kD membrane on the content of IGF-Ⅰand total protein

從表5可知，在超濾pH5.5時處于β-乳球蛋白(分子質量在30kD左右)等電點范圍內使其凝聚力增加，增

強了超濾膜對其的截流作用，此時IGF-Ⅰ的質量濃度及相對濃度均較高，因此選擇超濾pH5.5作為超濾分離IGF-Ⅰ的最適pH值。

由表6可看出，在36℃時IGF-Ⅰ的質量濃度及相對濃度均較高，原因可能為在溫度較高的條件下，液體黏度降低，流動性增加，有助于IGF-Ⅰ透過超濾膜，但是更高的溫度會使蛋白失活，造成IGF-Ⅰ的損失，不能作為可選的溫度參數來考察。因此選擇超濾溫度36℃作為超濾的最適溫度。

表7 超濾壓力對IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度的影響Table7 Effect of pressure during ultra-filtration with 10－12 kD membrane on the content of IGF-Ⅰand total protein

由表7可見，隨壓力的增大，IGF-Ⅰ的質量濃度及總蛋白質量濃度均升高，而相對質量濃度在0.06MPa時為最高，原因可能為壓力升高使大于截留分子質量的雜蛋白IGF-Ⅰ透過中空纖維，使得IGF-Ⅰ相對濃度降低，因此選擇0.06MPa作為超濾的最適壓力。

2.3.26 kD超濾膜超濾去除乳糖等小分子物質的相關條件

為了獲得更高純度的IGF-Ⅰ，研究用截留分子質量為6kD超濾膜是為了除掉乳糖和礦物質等小分子雜質，并對終產物進行濃縮。結果見表8～10。

表8 超濾pH值對 IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度的影響Table8 Effect of pH during ultra-filtration with 6 kD membrane on the content of IGF-Ⅰand total protein

由表8看出，在pH8.0時IGF-Ⅰ的質量濃度及相對濃度均較高，原因可能為IGF-Ⅰ的等電點在8.0左右，調節溶液的pH值為8.0時，IGF-Ⅰ的凝聚力增強，減少了對超濾膜的透過率，通過時增加了對其他雜蛋白的通透性。因此IGF-Ⅰ得到了進一步的純化。

表9 超濾溫度對IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度的影響Table9 Effect of temperature during ultra-filtration with 6 kD membrane on the content of IGF-Ⅰand total protein

由表9可見，在36℃時IGF-Ⅰ的質量濃度及相對濃度均較高，原因可能為升高溫度液體粘度降低，有助于乳糖等小分子黏性物質的通過，從而提高溶液中IGF-Ⅰ的質量濃度及相對濃度。

表10 超濾壓力對IGF-Ⅰ和總蛋白質量濃度的影響Table10 Effect of pressure during ultra-filtration with 6 kD membrane on the content of IGF-Ⅰand total protein

由表10看出，隨超濾壓力的增大，濃縮液中IGF-Ⅰ的質量濃度及總蛋白質量濃度均降低，原因可能為隨壓力增大，IGF-Ⅰ和大于截留分子質量的雜蛋白均透過中空纖維膜。IGF-Ⅰ的相對濃度在0.06MPa時為最高，其相對濃度較初乳中提高約3660倍，因此選擇0.06MPa作為超濾的最適壓力。

3 結 論

本研究最終確定從牛初乳中分離IGF-Ⅰ的脫脂工藝最適條件為采用4000r/min、15min、36℃離心條件下制備脫脂乳；經木瓜凝乳酶制備乳清后用酸醇溶液去除結合蛋白，然后采用10～20kD中空纖維超濾除雜蛋白，確定的最佳參數條件為溫度36℃、pH5.5、操作壓力0.06MPa；采用6kD中空纖維超濾去除乳糖等小分子物質，確定的最佳參數條件為溫度36℃、pH8.0、操作壓力0.06MPa；經過兩步超濾純化后，IGF-Ⅰ的相對濃度比初乳中增加3660倍。本研究獲得了高純度的IGF-Ⅰ產品，為采用規模化方法生產IGF-Ⅰ產品提供一定的參考價值。

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Use of Ultra-filtration for Separation of Insulin-like Growth Factor-Ⅰfrom Bovine Colostrums

GUO Hong，CHEN Qing-sen*，YAN Ya-li
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Insulin-like growth factors play important roles in the cell differentiation, animal growth, development, reproduction and metabolism, and are largely present in the bovine colostrums. In present study, insulin-like growth factor-Ⅰ(IGF-Ⅰ) was separated from bovine colostrums by using ultra-filtration, and the degreasing and ultra-filtration conditions were optimized. The IGF-Ⅰand total protein concentrations were detected by radio-immunoassay(RIA) and coomassie blue staining, respectively. The results showed that the optimum degreasing conditions were as follows: centrifugation temperature 36 ℃, centrifugation speed 4000 r/min and centrifugation time 15 min. Macromolecular impurities protein and lactose could be removed after ultra-filtration with molecular weight cut-off 10－20 kD and 6 kD membrane, respectively. The relative concentration of IGF-Ⅰwas 3660 times higher than that in colostrums after ultra-filtration.

colostrums；insulin-like growth factor-Ⅰ(IGF-Ⅰ)；lipid extraction；ultra-filtration；technological conditions

TS252.1

A

1002-6630(2010)22-0086-05

2010-07-19

天津市科技支撐計劃重點項目(09ZCKFNC00700)

郭洪(1983—)，男，碩士研究生，研究方向為發酵生物技術、乳品質量與安全。E-mail：gh20020700@sina.com

*通信作者：陳慶森(1957—)，男，教授，碩士，研究方向為發酵生物技術、乳品質量與安全。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn