αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇的識別

叢艷君，任發政*，云戰友

(1.北京工商大學化學與環境工程學院，北京 100048；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；3.內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010080)

αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇的識別

叢艷君1，任發政2,*，云戰友3

(1.北京工商大學化學與環境工程學院，北京 100048；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；3.內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010080)

以αs1-酪蛋白氨基酸序列為模板，錯位合成αs1-酪蛋白多肽，以收集到的牛乳過敏患者血清為抗體，鑒定αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇，分析影響致敏性的關鍵氨基酸，探討牛乳過敏機理。結果表明：αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇有5條，它們在αs1-酪蛋白的定位分別為aa21～35、aa26～40、aa91～105、aa141～155、aa186～200。影響αs1-酪蛋白致敏性的關鍵氨基酸為組氨酸、谷氨酸、脯氨酸。說明特異性水解抗原決定簇或定點修飾過敏原氨基酸實現脫敏的方法是可行的。

牛奶；αs1-酪蛋白；IgE；抗原決定簇

酪蛋白大約占牛乳總蛋白的80%，是牛乳主要過敏原之一[1]，它由αs1-、αs1-、β-、κ-酪蛋白4種組分構成，4種酪蛋白以37%、37%、1%和13%相對恒定的比例聚合成微粒-酪蛋白膠束，懸浮于乳清中[2]。αs1-酪蛋白是一條單鏈的磷酸化蛋白質，由199個氨基酸構成，脯氨酸含量較高[3]，沒有二硫鍵，三級結構比較簡單[4]，這些結構特點決定了αs1-酪蛋白的抗原決定簇以線性為主。

本研究應用固相合成肽的方法合成αs1-酪蛋白多肽，以收集到的牛乳過敏患者血清中的IgE為探針，鑒定定位過敏原抗原決定簇，探討牛乳過敏機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

αs1-酪蛋白多肽 實驗室合成；鏈霉親和素(streptavidin，SA) 北京博奧森生物技術有限公司；HRP標記的鼠抗人IgE(ε鏈特異性)、四甲基聯苯胺(TMB)、三氟乙酸(TFA) 美國Sigma公司；96孔聚苯乙烯酶標板 美國Costar公司。

1.2 儀器與設備

Bio-Rad 550型酶標儀 Bio-Rad公司；PSH500A生化培養箱 中國重慶銀河實驗儀器有限公司；Th-80D-2B型凍干機 北京天地精儀科技有限公司；高效液相Vydac C18柱 美國Vydac公司。

1.3 方法

1.3.1 多肽的合成[5]

采用Fmoc固相肽合成法，將C-末端氨基酸連接到一種合適的固相載體上，采用常規Fmoc法進行逐步縮合。合成結束后，用強酸將序列從固相載體上切割下來，經HPLC純化，冷凍干燥后備用。

1.3.2 合成肽純度的鑒定

采用高效液相色譜(RP-HPLC)和質譜進行分析。色譜柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相：A為體積分數0.1% TFA水溶液，B為乙腈，采用按體積分數梯度洗脫程序：0～5min，15% B；5～10min、20% B；10～30min，40% B。流速：1.0mL/min、檢測波長：220nm；柱溫：20℃。質譜條件：采用ESI離子源；噴霧壓力：15psi；干燥氣溫度：350℃；流速：5L/min；掃描質量范圍：m/z 500～2200。

1.3.3 牛奶過敏患者血清的收集

按照文獻[1]相關參數(典型的食物過敏史、皮膚點刺實驗、Immunol CAP實驗)篩選牛乳過敏患者血清。6份牛乳過敏患者血清用來識別αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇，以A～F表示。另外取5份血清等體積混合分析影響αs1-酪蛋白致敏性的關鍵氨基酸。

1.3.4 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)鑒定抗原決定簇及關鍵氨基酸

合成肽致敏性的檢測在96孔微板上進行，每孔均先用鏈霉親和素包被，分別依次加入待進行抗原決定簇鑒定的肽系列，再用抗體檢測，于450nm波長處測定光密度，具體操作參考文獻[6]。

2 結果與分析

2.1 αs1-酪蛋白肽的合成

表1 合成αs1-酪蛋白肽的氨基酸序列Table 1 Sequences of synthesized peptides based onαs1-casein

以αs1-酪蛋白氨基酸序列為模板，用Fmoc固相合成法錯位合成αs1-酪蛋白37條，見表1。

2.2 合成肽的純度鑒定

圖1 Biotin-LNENLLRFFVAPFPE的MS圖譜Fig.1 MS spectrum of Biotin-LNENLLRFFVAPFPE

圖2 Biotin-RQFYQLDAYPSGAWY的MS圖譜Fig.2 MS spectrum of Biotin-RQFYQLDAYPSGAWY

合成的多肽通過高效液相純化，純度都達到了80%以上，進一步通過質譜鑒定多肽的相對分子質量(加上生物素的相對分子質量)，圖1、2表明多肽相對分子質量誤差均小于5%，本實驗代表性地附上了兩條多肽(偶聯生物素)的質譜圖。

2.3 αs1-酪蛋白的IgE抗原決定簇

圖3 A～F牛乳過敏患者識別αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇Fig.3 Identification ofαs1-casein epitopes in cow milk allergic patients

由圖3可知，A患者識別到的抗原決定簇為A01、A02、A03、A16、A18、A26、A35；B患者識別到的抗原決定簇為A02、A03、A07、A20、A26、A30、A37；C患者識別到的抗原決定簇為A05、A13、A16、A26、A35；D患者識別到的抗原決定簇為A02、A05、A16、A22、A26、A31、A35；E患者識別到的抗原決定簇為A02、A03、A16、A18、A26、A35；F患者識別到的抗原決定簇為A02、A03、A07、A16、A18、A26、A35。

從圖3還可以看出，不同牛乳過敏患者識別到的抗原決定簇不同，A26的識別率為100%(6/6，即與6份血清均發生免疫反應)，A02、A16、A35的識別率為83.3% (5/6)，A03的識別率為66.7%(4/6)，個別過敏患者對A18、A07、A20、A22也有免疫反應，A26、A02、A16、A35、A03的識別率在60%以上，故為αs1-酪蛋白的IgE抗原決定簇，它們的氨基酸序列分別為：GIHAQQKEPMIGVNQ、IKHQGLPQEVLNENL、VEQKHIQKEDVPSER、TQYTDAPSFSDIPNP、LPQEVLNENLLRFFV，這些抗原決定簇在αs1-酪蛋白的氨基酸序列定位分別為aa141～155、aa21～35、aa91～105、aa186～200、aa26～40(圖4粗體部分)。用非牛乳過敏患者血清識別抗原決定簇的光密度值均小于0.1。

圖4 IgE抗原決定簇在αs1-酪蛋白序列中的定位Fig.4 Locations of IgE epitopes in the sequence ofαs1-casein

2.4 顯性抗原決定簇(GIHAQQKEPMIGVNQ)關鍵氨基酸的分析

圖5 影響αs1-酪蛋白致敏性的關鍵氨基酸Fig.5 Critical amino acids for the allergenicity ofαs1-casein

為了找到影響致敏性的關鍵氨基酸，本研究選用分

子較小的中性丙氨酸作為取代氨基酸(遇到丙氨酸以甘氨酸作取代)。用丙氨酸依次取代GIHAQQKEPMIGVNQ抗原決定簇的氨基酸，以未取代的抗原決定簇作空白對照，由圖5可知，第143位的組氨酸(H)被丙氨酸取代合成的肽光密度值接近零，第148位的谷氨酸(E)被丙氨酸取代合成的多肽及第149位的脯氨酸(P)被丙氨酸取代合成的多肽的IgE結合能力消失，其他氨基酸被取代后合成的多肽IgE結合能力與對照差異不顯著。因此組氨酸、谷氨酸、脯氨酸是影響αs1-酪蛋白致敏性的關鍵氨基酸。

3 討 論

牛奶酪蛋白組分是引起成年人和年長兒童過敏的主要過敏原，這表明酪蛋白在持續性牛乳過敏疾病中發揮著重要作用[7-8]。一般認為過敏原的致敏性是由蛋白的初級、二級及三級結構決定的。通過尿素、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸鈉或加熱方式處理α-酪蛋白，打破其二、三級結構，但是并未顯著影響到α-酪蛋白的致敏性[9]，這表明α-酪蛋白的初級結構(序列抗原決定簇)對其致敏性變化影響最顯著。

Chatchatee等[10]采用96個重疊十肽，確定了αs1-酪蛋白6個主要和3個次要IgE抗原決定簇。Elsayed等[11]用溴化氫將αs1-酪蛋白裂解為7個肽段，除了一個肽段只含3個氨基酸外，其余均可以被T細胞識別，從而確定了7個T細胞識別表位。在此基礎上，Ruiter等[12]采用了32個重疊肽分析T細胞識別表位，其中肽鏈43～66位、73～96位、91～114位、127～180位均可被3個病人的T細胞所識別，而肽鏈133～156位則被50%以上過敏病人的T細胞所識別，說明此區域為T細胞主要識別表位。本研究識別到αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇5條，這些抗原決定簇在αs1-酪蛋白的氨基酸序列定位分別為aa141～155、aa21～35、aa91～105、aa186～200、aa26～40，抗原決定簇aa91～105與Ruiter等[12]發現的肽鏈91～114位是一致的，抗原決定簇aa141～155、aa21～35、aa186～200、aa26～40是之前研究沒有報道過的。

關于αs1-酪蛋白抗原決定簇的關鍵氨基酸的研究報道很少。Cocco等[13]研究表明：以牛乳過敏患者混合血清為抗體，取代αs1-酪蛋白單個氨基酸可以降低或消除抗原決定簇IgE結合能力，這與本研究的結論是一致。

4 結 論

本研究識別的αs1-酪蛋白IgE抗原決定簇定位分別為aa141～155、aa21～35、aa91～105、aa186～200、aa26～40，通過對肽鏈141～155取代分析表明，取代單個氨基酸可以降低或消除αs1-酪蛋白IgE結合能力。

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Identification of IgE-binding Epitopes on αs1-Casein

CONG Yan-jun1，REN Fa-zheng2,*，YUN Zhan-you3
(1. School of Chemical and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；3. Inner Mongolia Yili Industrial Group Co. Ltd., Hohhot 010080, China)

A series of casein overlapping decapeptides (offset by 5 amino acids) were synthesized on the basis of the sequence of αs1-casein. IgE-binding epitopes were identified using individual sera from cow milk allergic patients. Moreover, the critical amino acids (AAs) for IgE binding were explored. The results indicated that five IgE-binding epitopes were identified to locate in the sequence of aa21－35, aa26－40, aa91－105, aa141－155 and aa186－200, respectively. In addition, histidine, glutamic acid and proline were the critical amino acids for the allergenicity of αs1-casein.

cow milk；αs1-casein；IgE；epitope

TS252.1

A

1002-6630(2010)17-0232-04

2010-01-02

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD04A06)

叢艷君(1978—)，女，講師，博士，主要從事功能乳制品研究。E-mail：congyj@th.btbu.edu.cn

*通信作者：任發政(1962—)，男，教授，博士，主要從事功能乳制品研究。E-mail：renfazheng@263.net