煙堿協同過氧化氫對紅酵母累積番茄紅素的影響

王海兵，吳曉英*，梁文志，謝羽娜，袁思敏

(華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006)

煙堿協同過氧化氫對紅酵母累積番茄紅素的影響

王海兵，吳曉英*，梁文志，謝羽娜，袁思敏

(華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006)

研究煙堿、雙氧水這兩種效應物對紅酵母發酵累積番茄紅素的影響，發現其加入的量和加入的時間對累積量影響顯著。結果表明，在紅酵母發酵至36h時，同時加入2.5mL/L煙堿和1.6mL/L雙氧水(含30%的過氧化氫)，可使番茄紅素得到大量的積累，達到86.88mg/L，是不加煙堿和雙氧水時番茄紅素產量4.10mg/L的21.2倍。

紅酵母；番茄紅素；效應物；煙堿；過氧化氫

番茄紅素是一種具有11個共軛雙鍵的不飽和碳氫化合物，是類胡蘿卜素的一種。作為一種天然脂溶性色素，番茄紅素在自然界中分布廣泛，主要存在于番茄、胡蘿卜、西瓜、紅色胡椒粉、紅色葡萄柚以及紅色棕櫚油中。研究發現，番茄紅素有很強的抗氧化作用，其對單線氧的消除能力是β-胡蘿卜素的2倍，在類胡蘿卜素中最強；同時番茄紅素還具有對自由基的清除、阻斷形成亞硝胺、對細胞增殖的抑制作用、誘導細胞分化、增加免疫力、減少DNA損傷以及促進細胞間隙連接通訊等作用[1-2]，是一種很重要的生物活性物質，并且在預防和治療前列腺癌、乳腺癌等癌癥，增強人體免疫功能以及心血管疾病方面有巨大的潛力[3]。

目前國內外應用的番茄紅素的來源主要有兩個方面：植物提取法和微生物發酵法。用植物提取法制取番茄紅素，雖然原料來源廣泛易得，但是含量較低、副產物較多，原料供應受到氣候與季節的影響較大，使得生產成本較高；與此相比，微生物發酵法具有生產周期短、生產菌可基因改造而大幅提高產量、易于放大和工業化生產等優點，被廣泛地應用于實際工業生產中。目前，生產天然類胡蘿卜素的主要菌種為三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)和紅酵母(Rhodotorular)。雖然與三孢布拉氏霉相比，紅酵母的單位產量比較低，但由于其具有營養要求簡單、生長周期短及菌體營養豐富等許多優點，具有很高的實用價值和很好的工業開發前景。

一般情況下，微生物合成的主要類胡蘿卜素，是番茄紅素經過環化和氧化等之后的衍生物，如β-胡蘿卜素、玉米黃素、蝦青素等[4]。因此，針對類胡蘿卜素這樣的一個合成途徑，可以從兩個方面來提高番茄紅素的累積：一是要加強和促進類胡蘿卜素合成途徑，二是要控制番茄紅素后續的過程，阻止其環化反應。目前有人已開始嘗試利用代謝控制手段，在微生物發酵法生產類胡蘿卜素時，發酵到一定時間點時添加環化抑制

劑、氧化劑等效應物，使菌體產生和累積番茄紅素[5-7]，取得了較好的結果。

過氧化氫有很好的氧化性，發酵過程中它的加入會使紅酵母產生強烈的抗逆應激反應，大大促進其類胡蘿卜素合成代謝的進行；煙堿是類胡蘿卜素合成途徑中番茄紅素環化酶的良好抑制劑，它的加入可有效阻止途徑中的環化反應，導致番茄紅素的大量累積。本實驗以黏紅酵母為出發菌株，在優化的類胡蘿卜素發酵條件下，分別考察加入不同煙堿量和同時加入不同的雙氧水量對合成番茄紅素的影響，并在不同的培養時間里，分別添加氧化劑雙氧水和環化抑制劑煙堿兩種效應物，以黏紅酵母中的番茄紅素達到大量積累。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實驗室篩選得到的一株類胡蘿卜素高產菌黏紅酵母2.27。

1.2 試劑與儀器

番茄紅素標準品 上海融和醫藥公司；煙堿(95%)西安天則生物技術有限責任公司；雙氧水(含體積分數30%H2O2的水溶液)。

SHP-450D型生化培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；SKYB2112B型恒溫搖床 廣州科橋實驗技術設備有限公司；LD5-2A低速離心機 北京醫用離心機廠；2802S型紫外分光光度計 尤尼科(上海)儀器有限公司；1525型高效液相色譜儀、2487型紫外分光檢測器 Waters公司。

1.3 培養基和培養方法

斜面活化培養基：葡萄糖2g/100mL、蛋白胨1g/100mL、酵母粉1g/100mL、瓊脂2g/100mL、自然pH值。液體種子培養基：葡萄糖2g/100mL、蛋白胨1g/100mL、酵母粉1g/100mL、自然pH值。液體發酵培養基：葡萄糖5g/100mL、蛋白胨1.5g/100mL、酵母粉 1g/100mL、核黃素 0.5mg/L、吐溫-80 1.5%(體積分數)、初始pH5。

種子斜面活化培養：挑黏紅酵母一環，接入斜面活化培養基中，28℃培養48h；液體種子培養：從活化了的斜面種子中挑取培養物兩環，接于裝有30mL液體種子培養基的250mL三角瓶內，28℃條件下200r/min振蕩培養24h；液體發酵培養：以5%的接種量，將液體種子接入到裝有25mL發酵培養基的250mL三角瓶中，在光照條件下，28℃，200r/min振蕩培養96h。

1.4 生物量的測定

發酵結束后，取10mL發酵液轉入離心管中，以4000r/min離心10min，棄上清液，沉淀水洗后再次離心，得酵母泥，于55℃過夜烘干，稱干質量。

1.5 番茄紅素的提取

發酵結束后，參照文獻采用熱酸法破壁[8]，丙酮浸提：取發酵液10mL轉入離心管中，以4000r/min離心10min，沉淀水洗后得酵母泥；加入3mol/L的HCl溶液5mL，混合均勻后浸泡1.5h，然后再沸水浴4min，迅速冷卻，再4000r/min離心20min，得沉淀水洗2次，離心得到菌體殘片；加入丙酮9mL，混合均勻，浸提1h，4000r/min離心20min，得到色素丙酮浸提液。

1.6 番茄紅素含量測定方法

將色素提取液用0.22μm的微孔濾膜過濾后，以高效液相色譜法(HPLC)測定提取液中番茄紅素的含量。同時配制不同濃度的標準品溶液，在相同條件下測定，根據峰面積制備標準曲線定量。

Waters-1525高效液相色譜儀；色譜柱為：C-18硅膠柱(250mm×4.6mm，5μm)；Binary高效泵；檢測器為：Waters-2487，DoubleλAbsorbance Detector；數據分析軟件：Breeze。

高效液相色譜條件：流動相為乙腈和二氯甲烷，其體積比為10:90，檢測波長為472nm，流速為1.0mL/min，柱溫為28℃，進樣量為10μL。

2 結果與分析

2.1 番茄紅素標準曲線

準確稱量2.5mg的番茄紅素標準品，用丙酮溶解，定容于10mL的棕色容量瓶中，質量濃度為250μg/mL。再分別稀釋成50、100、150、200、250μg/mL的質量濃度梯度，過濾后HPLC檢測，數據處理，得到峰面積與質量濃度的關系曲線如圖1。

圖1 番茄紅素標準曲線Fig.1 Standard curve of lycopene

2.2 環化酶抑制劑煙堿的加入量對番茄紅素積累的影響

當液體發酵到48h時，加入不同量的煙堿，測定環化酶抑制劑的不同加入量對黏紅酵母累積番茄紅素的影響(見圖2)。

從圖2可以看出，隨著環化酶抑制劑煙堿加入量的增加，黏紅酵母菌體的生物量和番茄紅素的累積量都先

增大后減小。在1.25mL/L的煙堿加入量時，黏紅酵母生物量達到最大，為20.36g/L；在2.5mL/L的加入量時，番茄紅素的累積量達到最大，為19.93mg/L。雖然2.5mL/L的煙堿加入量對黏紅酵母的生物量的增加會有一定的不利影響，但卻極大的促進了番茄紅素的累積，因此，選擇2.5mL/L為煙堿的最佳加入量。

圖2 煙堿添加量對番茄紅素合成的影響Fig.2 Effect of amount of individually added nicotine on the biosynthesis of lycopene

2.3 添加環化抑制劑煙堿的同時，氧化劑雙氧水的加入量對番茄紅素累積的影響

黏紅酵母發酵的過程中，在發酵至48h時加入2.5mL/L煙堿的同時，加入不同量的雙氧水(含30%H2O2的水溶液)，對黏紅酵母累積番茄紅素的影響見圖3。

圖3 H2O2添加量對番茄紅素合成的影響Fig.3 Effect of amount of hydrogen peroxide added together with nicotine on the biosynthesis of lycopene

從圖3可以看出，隨著雙氧水加入量的增加，黏紅酵母的生物量呈現微弱增大的趨勢，而番茄紅素累積量則是先增大后減小。在3.2mL/L的雙氧水加入量時，黏紅酵母生物量達到最高，為22.34g/L；在1.6mL/L的加入量時，番茄紅素的累積量達到最大，為65.84mg/L。在這種雙氧水添加量比較小的情況下，雙氧水的加入實際上增加了發酵液的溶氧含量，促進了菌體的生長，所以生物量隨添加量的增大而增大；過氧化氫的氧化性刺激，激發了菌體的應激反應，促進了抗氧化性類胡蘿卜素合成途徑的進行，但過量過氧化氫又會消耗一部分生成的番茄紅素，所以，番茄紅素的累積量先上升后下降。綜合考慮，選擇雙氧水1.6mL/L為最佳加入量。

2.4 環化抑制劑和雙氧水不同時間加入對番茄紅素累積的影響

液體發酵黏紅酵母生產類胡蘿卜素的過程中，分別在不同的時間點加入2.5mL/L的環化抑制劑煙堿和1.6mL/L的氧化劑雙氧水，最后番茄紅素的累積量見圖4。

圖4 兩種效應物的加入時間對番茄紅素合成的影響Fig.4 Effect of addition time point for the two effectors on the biosynthesis of lycopene

從圖4可以看出，隨著環化抑制劑與雙氧水同時加入時間的推移，黏紅酵母生物量是逐漸增大的，番茄紅素的累積量先增大，后顯著減小。在發酵至72h同時加入環化酶抑制劑和過氧化氫，菌體的生物量達到了最大，為22.19g/L；在發酵至36h時同時加入，番茄紅素的累積量達到了最大，為86.88mg/L。

環化抑制劑和過氧化氫都會對菌體生物量的增加產生一定的不利作用，特別在發酵早期加入影響更大，而隨著發酵時間的延長，菌齡的增長和菌體的成熟，其抗逆性也增強了，所以，后期的加入并不會顯著影響菌體的生物量，因而出現菌體生物量隨煙堿和過氧化氫加入時間的推移而增大；類胡蘿卜素是黏紅酵母的一種次生代謝產物，主要在發酵對數后期和穩定期時合成，因此必須在穩定期前加入環化抑制劑和過氧化氫，這樣才能讓番茄紅素大量積累，所以出現在穩定期前加入以上兩種效應物時，番茄紅素的累積量大幅上升的現象。

圖5、6、7分別是番茄紅素標準品丙酮溶液、黏紅酵母發酵至36h時同時添加了2.5mL/L的環化抑制劑煙堿和1.6mL/L的氧化劑雙氧水的菌體丙酮浸提液和未添加煙堿和雙氧水的發酵菌體丙酮浸提液在相同的色譜條件下，經過HPLC后得到的色譜圖。

圖5 番茄紅素標準品的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC profile of lycopene standard

圖6 發酵至36h時添加兩種效應物的發酵菌體浸提液的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC profile of the extract from Rhodotorula cells with additions of the two effectors at 36 h of fermentation

圖7 不加效應物的發酵菌體浸提液的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC profile of the extract from Rhodotorula cells without additions of the two effectors

從圖5、6可以看出，添加了效應物的黏紅酵母菌體的丙酮提取液中主要成分為番茄紅素(保留時間分別為3.470min、3.506min，基本一致)，再根據圖6、7的曲線比較，可以看到未添加效應物前，番茄紅素含量很少，產物主要是環化和氧化了的類胡蘿卜素，添加了效應物后，環化的類胡蘿卜素大大減少了，而番茄紅素量卻顯著增加。因此可以得出，煙堿和雙氧水的加入極大的阻礙了類胡蘿卜素合成中的環化過程，導致了大量番茄紅素的累積。

3 結論與討論

本研究以煙堿和雙氧水作為效應物，在黏紅酵母2.27發酵至36h時，向發酵培養基中同時添加2.5mL/L的環化抑制劑煙堿和1.6mL/L的氧化劑雙氧水，可使菌體大量累積番茄紅素，達到86.88mg/L，是不添加這兩種物質時產量(4.10mg/L)的21.2倍。本研究中黏紅酵母2.27番茄紅素產量，比楊建明等[5]報道的紅酵母番茄紅素產量(11.79mg/L)、汪福源等[9]誘變得到的突變紅酵母番茄紅素產量(5.53mg/L)都高出很多；同時，由于煙堿易揮發，易溶于水，在色素提取中可方便去除；雙氧水分解產物為水，安全無毒，可滿足醫藥和食品行業對番茄紅素生產的標準，可直接在實際生產中應用，因此，本研究結果對于進一步的生產應用有重要的參考價值。

隨著大量研究工作的展開，類胡蘿卜素的生物合成途徑已經研究清楚，各反應中作為催化劑的酶的基因也已測序出來，為生產番茄紅素提供了很好的借鑒。利用類胡蘿卜素合成途徑的代謝控制手段，可以嘗試從以下幾個方面去增加番茄紅素的累積發酵水平[10]：1)構建新的代謝流來生產番茄紅素。2)增強番茄紅素合成代謝流：增加IPP 、GGPP 等前體底物的代謝流提高產量；尋找代謝途徑的關鍵酶，加速限速反應，增強八氫番茄紅素代謝流提高產量。3)打斷其他競爭代謝流提高產量。

本研究就是利用煙堿作為環化抑制劑，打斷了番茄紅素繼續轉化成其他類胡蘿卜素的代謝流；同時以雙氧水為氧化劑，對黏紅酵母的刺激增強了番茄紅素的合成代謝流，才得以使番茄紅素大量積累。從理論上講，還可以利用基因敲除或iRNA沉默技術[11]，終止番茄紅素環化酶基因的表達，使其得到積累，或者添加麥角固醇合成抑制劑[12]，阻抑麥角固醇的合成代謝，使兩者共同前體累積，以此增加番茄紅素合成，或者添加前體MVA合成酶的激活劑青霉素[13]，促進番茄紅素的積累。目前的工作正在嘗試從更多的方面加以實驗，考察不同效應物以及它們之間的相互作用，以便將黏紅酵母的番茄紅素積累水平進一步提高。

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Effect of Simultaneous Additions of Nicotine and Hydrogen Peroxide on the Biosynthesis of Lycopene in Rhodotorula

WANG Hai-bing，WU Xiao-ying*，LIANG Wen-zhi，XIE Yu-na，YUAN Si-min
(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

The effect of simultaneously added nicotine and hydrogen peroxide on lycopene accumulation during Rhodotorula fermentation was explored. Amounts and addition time point of nicotine and hydrogen peroxide significantly affected the biosynthesis of lycopene during fermentation. A maximum lycopene content of 86.88 mg/L was achieved after Rhodotorula fermentation for 36 h with additions of 2.5 mL/L nicotine and 1.6 mL/L hydrogen peroxide, which was 21.2 times higher than that without additions of nicotine and hydrogen peroxide.

Rhodotorula；lycopene；effector；nicotine；hydrogen peroxide

TS201.3

A

1002-6630(2010)17-0254-04

2010-01-19

華南理工大學學生研究計劃項目(SRP)

王海兵(1986—)，男，碩士研究生，主要從事生物制藥研究。E-mail：2004seaside@163.com

*通信作者：吳曉英(1961—)，女，副教授，碩士，主要從事生物制藥和生物活性物質的研究。

E-mail：xywu@scut.edu.cn