高效產脂肪酶菌株Burkholderia cepacia C1產酶條件優化

于玉鳳，陸兆新，汪 瑾，陳舟舟，盧亞萍,,*

(1.南京農業大學生命科學學院，江蘇 南京 210095；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

高效產脂肪酶菌株Burkholderia cepacia C1產酶條件優化

于玉鳳1，陸兆新2，汪 瑾1，陳舟舟1，盧亞萍1,2,*

(1.南京農業大學生命科學學院，江蘇 南京 210095；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

從油菜地土壤中分離到一株高效產脂肪酶菌株C1，經鑒定為Burkholderia cepacia。為了進一步提高C1脂肪酶的產量，對其產酶的發酵條件進行優化。首先采用單因子試驗篩選出最佳碳源為麩皮，最佳氮源為蛋白胨。通過Plackett-Burman設計對發酵產酶的11個相關因子進行試驗，篩選出3個主效因子，即蛋白胨質量濃度、橄欖油質量濃度及裝液量。利用Box-Behnken試驗設計和響應曲面法分析確定主效因子的最優水平，得出產脂肪酶菌株C1的最優產酶條件：1.50g/100mL麩皮、1.05g/100mL蛋白胨、1.63g/100mL橄欖油、0.2g/100mL K2HPO4、0.05g/100mL MgSO4、初始pH值為7.0、裝液量為30mL。在優化條件下30℃，180r/min培養72h，脂肪酶活力達到89.65U/mL，比未優化前的28.50U/mL提高了2.15倍。

脂肪酶；Plackett-Burman設計；響應曲面；發酵優化

脂肪酶(EC3.1.1.3)是一類重要的甘油酯鍵水解酶，廣泛存在于動物、植物各種組織及微生物中，可以在油水界面上催化脂類物質分解、合成和酯交換等反應，是最早研究的酶類之一[1]。微生物脂肪酶具有種類多、比動物脂肪酶具有更廣的作用pH值和作用溫度范圍、便于進行工業生產和獲取高純度制劑等優點而在多個行業得到廣泛應用，如食品、制革、飼料、洗滌、油酯化工等[2-3]。不同種屬的微生物所產生的脂肪酶具有不同的催化特性，因此人們致力于發現具有不同催化特性(如耐高溫、耐低溫、耐有機溶劑、位置和底物選擇性)的脂肪酶產生菌以滿足不同的工業生產需求。從自然界尋找產生優良特性的脂肪酶的菌株，是促進脂肪酶研究

與應用的有效途徑之一。

Burkholderia屬細菌所產脂肪酶具有活性高、耐高溫、耐有機溶劑、耐表面活性劑等優良特性，已被深入研究并應用于工業生產[4-5]。本實驗從油菜地土壤中分離高效產脂肪酶菌株，經形態學、生化特性及16S rDNA鑒定該菌為Burkholderia cepacia。響應曲面法等發酵條件優化方法常被用于提高菌株的產酶量，如Dandavate等[6]、汪小鋒等[7]用響應曲面法優化洋蔥假單胞菌PCL-3的產脂肪酶發酵條件，將產酶活性提高了1.93倍。本實驗采用響應曲面法對B. cepacia C1菌的產酶條件進行優化，旨在為進一步規模生產、分離純化及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣

本實驗所用土壤樣品采自江蘇農業科學院多年種植油菜的試驗田。

1.1.2 培養基

富集培養基：酵母抽提物2g/L、橄欖油5g/L、K2HPO41g/L、MgSO40.1g/L、(NH4)2SO41g/L、NaCl 0.5g/L，自然pH值；初篩培養基：乳化橄欖油10g/L、K2HPO41g/L、MgSO40.1g/L、(NH4)2SO41g/L、KCl 0.5g/L、瓊脂粉15g/L，自然pH值；羅丹明B復篩培養基：LB平板中添加0.001% 羅丹明 B和1%乳化橄欖油；產酶基礎培養基：葡萄糖10g/L、酵母抽提物5g/L、K2HPO42g/L、橄欖油10g/L、MgSO40.5g/L，自然pH值。

1.2 儀器與設備

UV-2450分光光度計 日本島津公司；Sartorious 電子精密天平 北京賽多利斯天平有限公司；5804R 冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；ZD-88-3型雙層落地恒溫振蕩器 太倉市光明實驗分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種篩選

5g土壤置于45mL生理鹽水中，加玻璃珠打散。移取5mL到45mL富集培養基，37℃培養2～4d。富集培養液梯度稀釋后，涂布到以橄欖油為唯一碳源的初篩平板上，37℃培養2～4d。從初篩平板上挑取有水解圈的菌落，用無菌牙簽接種到羅丹明B復篩平板上，37℃培養2～4d。觀察并測量菌落周圍熒光圈的大小。選取熒光圈直徑/菌落直徑較大的菌落，劃線分離后接種到LB平板中過夜培養，種子液接入產酶基礎培養基中，30℃振蕩培養，24h后每隔6h取樣測酶活力。

1.3.2 脂肪酶活力的測定

脂肪酶活力測定參照Lee等[8]的方法，略作修改。取10μL發酵上清液、100μL 10mmol/L對硝基苯丁酯(pNPB)加入到2.89mL pH7.4磷酸緩沖液(PBS)中，40℃酶促反應，測定產物對硝基苯酚在波長410nm處的吸光度。以已知物質的量(0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 μmol)的對硝基苯酚作標準曲線，計算酶活力。每分鐘產生1μmol對硝基苯酚定義為1個酶活力單位。

1.3.3 菌種的鑒定

根據《伯杰細菌鑒定手冊》[9]，對篩選的菌體進行表型和生理生化實驗鑒定。另外，以脂肪酶菌株C1基因組DNA為模板，16S-F(5＇-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3＇)和16S-R(5＇-GGTTACCTTG TTACG ACTT-3＇)為引物，通過PCR擴增其16S RNA的編碼基因。將擴增片段回收后測序，序列在NCBI上檢索比對。

2 結果與分析

2.1 產脂肪酶菌株的篩選

通過多輪初篩和復篩，得到40株產脂肪酶的細菌。從羅丹明B復篩培養基平板上挑取有明顯水解圈的菌落(圖1)，接種到基礎產酶培養基中培養。在培養至72h時，其中的一株產酶量最高，酶活力可達到28.50U/mL，命名為C1。C1菌落呈白色，表面光滑不透明，突起，易挑起，有淡淡的異味。通過生理生化特性及16S DNA序列分析，確定C1為Burkholderia cepacia。

本實驗對C1脂肪酶粗酶液作了初步的酶學性質研究，發現它是高溫脂肪酶(最適溫度為60℃)，最適pH值為9.0，對大部分有機溶劑(甲醇、異丙醇、丁醇、甘油、乙酸乙酯、正己烷、甲苯等)具有很好的耐受性。由此確定C1脂肪酶是一種具有優良特性的脂肪酶，以下實驗通過改善發酵條件來提高其脂肪酶的產量。

2.2 最佳碳、氮源的選擇

改變產酶培養基中碳源的種類，以質量濃度分別為0.5g/100mL和1g/100mL的蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、玉米粉、淀粉、麩皮和米糠作為碳源進行實驗。在篩選出最佳碳源的基礎上，分別以酵母膏、蛋白胨、牛

肉膏、大豆粉、尿素、(NH4)2SO4和KNO3作為氮源進行發酵，測定發酵72h時的酶活力。

圖1 產脂肪酶菌落在羅丹明B復篩培養基平板上的形態Fig.1 Morphology of lipase-producing strains on Rhodamine B plate

圖2 不同碳源對產酶的影響Fig.2 Effect of carbon source type on lipase production

圖3 不同氮源對產酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source type on lipase production

由圖2可見，麩皮是最合適的碳源，1g/100mL麩皮作為碳源時酶活力最高。以1g/100mL麩皮作為碳源，1g/100mL蛋白胨作為氮源時，脂肪酶產量最高(圖3)。因此在隨后的實驗中選擇麩皮和蛋白胨作為培養基的碳源和氮源。

2.3 響應面法優化產酶條件

2.3.1 Plackett-Burman設計篩選影響產酶的主效因子

依據已確定的碳源和氮源，以培養基中各種成分質量濃度及pH值、裝液量、接種量、培養時間、培養溫度等11個因素作為研究對象，考查各個因子對C1菌株產酶的影響。實驗采用二水平Plackett-Burman設計，每個因子取高(+1)低(－1)兩個水平，實驗設計及結果見表1、2。

表1 Plackett-Burman 試驗設計結果及預測值Table 1 Plackett-Burman design matrix and actual and predicted values of lipase activity

表2 Plackett-Burman試驗各因素水平及結果分析Table 2 Significance test for each factor

由表2可知，對產酶活性有顯著影響(置信度大于95%)的因素有蛋白胨質量濃度、橄欖油質量濃度和裝液量。這3個顯著因素中，蛋白胨質量濃度和裝液量對產酶活性為負效應，橄欖油質量濃度為正效應，對產酶的影響可以用以下方程表示：＝55.3608－9.4691X＋15.8925X3－8.7803X7，該方程的決定系數R2值為0.956，表明該回歸方程擬合良好。根據t檢驗結果可知蛋白胨質量濃度、橄欖油質量濃度和裝液量為重要因素，適當提高橄欖油質量濃度、降低蛋白胨質量濃度和減少裝液量均能促進產酶活性的提高。其他因子對產酶影響不大，均選擇低水平。

2.3.2 Box-Behnken 試驗設計及結果

Plackett-Burman試驗結果表明，對菌株C1產酶活

性具有顯著影響的因子有蛋白胨質量濃度、橄欖油質量濃度和裝液量。為了確定顯著因子的最優水平，利用響應曲面法(Box-Behnken設計)對影響菌株C1產酶活性的主效因子進一步優化。以酶活力為響應值，主效因子的水平為自變量，借助試驗設計軟件Design-Expert version 6.0.10 Trial，進行Box-Behnken試驗設計，設計方案及結果見表3、4。

表3 Box-Behnken試驗因素水平表Table 3 Factors and levels in the Box-Behnken design

表4 Box-Behnken試驗設計及響應值的實測值和預測值Table 4 Box-Behnken design matrix and actual and predicted values of lipase activity

利用Design Expert 6.0.1 Trial軟件對表4的數據進行二次多項回歸擬合，獲得產酶活力(Y)對蛋白胨質量濃度(X1)、橄欖油質量濃度(X3)、裝液量(X7)的二次多項回歸方程：

Y＝88.15＋0.27X1＋7.71X3－6.56X7－20.83X12－14.97X32－19.45X72＋9.95X1X3－8.85X1X7＋10.28X3X7

表5 二次多項式模型方差分析Table 5 Variance analysis for the developed quadratic polynomial model

由表5可知，該模型極顯著(P=0.0006)，失擬項在α=0.05水平上不顯著(P=0.2727＞0.05)。該模型的R2= 0.9567，R2Adj=0.9011表明模型與實際情況擬和較好，適用于菌株C1產脂肪酶活力的理論預測。

表6 二次多項回歸方程系數的顯著性檢驗Table 6 Significance test of each regression coefficient for the developed quadratic polynomial model

由表6可知，橄欖油質量濃度和裝液量對C1菌株產脂肪酶活性的線性效應顯著(α=0.05)，但蛋白胨質量濃度線性效應不顯著；相比較而言，各因素的曲面效應極為顯著(α=0.01)；各因素間的交互作用顯著。

2.3.3 響應面優化結果的分析

由二次回歸方程所作的響應曲面圖及其等高線圖見圖4～6。各因素及其交互作用對響應值的影響可通過該組圖直觀地反映出來。

圖4 橄欖油質量濃度和蛋白胨質量濃度對酶活力影響的響應曲面和等高線Fig.4 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of olive oil concentration and peptone concentration on lipase activity

圖4顯示，當裝液量在最優水平(30mL)時，橄欖油質量濃度和蛋白胨質量濃度交互作用顯著，隨著橄欖油質量濃度和蛋白胨質量濃度的逐漸增加，C1菌株的產酶活性也逐步增加，二者似乎存在協同效應，即在一定質量濃度范圍內，只有兩種物質質量濃度同時升高時，才能相對多地提高C1菌株的產酶活性。橄欖油可視為細菌的一種較好的碳源，在本實驗中橄欖油既充當了誘導物又充當了部分碳源[10-12]。而當橄欖油質量濃度繼續升高時，會抑制C1菌株的產酶活性，可能是因為菌體繁殖過快，不利于產物的積累。

圖5 裝液量和蛋白胨質量濃度對酶活力影響的響應曲面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of volume of medium contained in shake flask and peptone concentration on lipase activity

圖5 顯示，當橄欖油質量濃度為最優水平(1.5g/100mL)時，裝液量和橄欖油質量濃度交互作用顯著。隨著裝液量的逐漸減少和蛋白胨質量濃度的逐漸增大，C1菌株的產酶活性逐漸增大。裝液量減少，增加了發酵液中的含氧量，有利于菌體的繁殖和產酶，此時需較多的蛋白胨來提供營養。但當裝液量減小到一定程度時反而抑制產酶的活性，這可能是由于菌體濃度過大，有害代謝產物積累多造成的，也可能是由營養成分的不足導致。

圖6顯示，當蛋白胨質量濃度為最優水平(1g/100mL)時，裝液量和橄欖油質量濃度的交互作用顯著。在一定范圍內，當裝液量增大時，需增大橄欖油的質量濃度。

圖6 裝液量和橄欖油質量濃度對酶活力影響的響應曲面和等高線Fig.6 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of volume of medium contained in shake flask and olive oil concentration on lipase activity

對Y進行嶺分析，Y的最大值估計在89.49U/mL，此時3個因子的最優試驗點(X1，X3，X7)分別為1.05g/100mL、1.63g/100mL、30mL。為驗證模型的準確性，在此條件下做了4組驗證實驗，實測的酶活力均值為89.65U/mL。這與模型預測值較為接近，說明該模型能較好地預測實際發酵情況。

3 結 論

本實驗從土壤中篩選得到了一株高產脂肪酶的菌株C1，經鑒定為B. cepacia，并對C1菌株發酵產酶的條件進行了優化。首先確定最優碳、氮源分別為蛋白胨和麩皮，其次通過Plackett-Burman試驗設計對培養基的各種成分和培養溫度、培養時間、起始pH值及接種量等11個相關因素進行篩選，得出橄欖油質量濃度對產酶活性的影響為正效應，蛋白胨質量濃度和裝液量對產酶活性的影響為負效應，其他相關因素沒有顯著效應。然后通過Box-Behnken 試驗設計和響應曲面分析法對C1菌株產酶活性有顯著影響的3個因素進行優化組合，最終獲得最優產酶條件為：麩皮質量濃度1.50g/100mL、蛋白胨質量濃度1.05g/100m L、橄欖油質量濃度1.63g/100mL、K2HPO4質量濃度0.2g/100mL、MgSO4質量濃度0.05g/100mL、起始pH7.0，裝液量30mL/250mL，接種量0.5%，溫度30℃，搖床轉速180r/min，培養時間為72h。在此條件下，進行驗證實驗獲得產酶活性為89.65U/mL，比未優化前的28.50U/mL提高了2.15倍。

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Optimization of Lipase Production from Burkholderia cepacia C1

YU Yu-feng1，LU Zhao-xin2，WANG Jin1，CHEN Zhou-zhou1，LU Ya-ping1,2,*
(1. College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

A stain C1 with high ability to produce lipase was isolated from soil and identified as Burkholderia cepacia. In order to improve the production of lipase, some fermentation conditions were optimized. The optimal carbon source and nitrogen source were determined to be bran and peptone according to single-factor experiments, respectively. Three key factors such as bran, peptone and liquid volume were selected out of eleven factors affecting lipase production by Plaekett-Burman design, and were further optimized by Box-Behnken design and response surface methodology. A maximum lipase activity of 89.65 U/mL was obtained after 72 h fermentation of 30 mL of a fermentation medium composed of wheat bran 1.50 g/100 mL, peptone 1.05 g/100mL, olive oil 1.63 g/100 mL, K2HPO40.2 g/100 mL and MgSO40.05 g/100 mL at an initial pH of 7.0 with 180 r/ min shaking, which was 2.15 times higher than before optimization (28.50 U/mL).

lipase；Plackett-Burman design；response surface methodology；fermentation optimization

Q936

A

1002-6630(2010)17-0218-06

2009-12-21

江蘇省高技術計劃項目(BE2008308)；國家“863”計劃項目(2008AA10Z309)；

江蘇省自然科學基金項目(BK2007160)

于玉鳳(1987—)，女，本科生，研究方向為生物技術及微生物發酵。E-mail：yuyufeng.good@163.com

*通信作者：盧亞萍(1978—)，女，博士，研究方向為生物技術、食品酶學。E-mail：lyphwq@njau.edu.cn