胭脂紅酸清除自由基的作用

郭元亨，馬李一，鄭 華，張 弘*，甘 瑾，李 坤

(中國林業科學研究院資源昆蟲研究所，國家林業局資源昆蟲培育與利用重點實驗室，云南 昆明 650224)

胭脂紅酸清除自由基的作用

郭元亨，馬李一，鄭 華，張 弘*，甘 瑾，李 坤

(中國林業科學研究院資源昆蟲研究所，國家林業局資源昆蟲培育與利用重點實驗室，云南 昆明 650224)

以DPPH自由基、ABTS+·及O2－·3種自由基為實驗對象，通過比較特定波長下自由基溶液吸光度的變化，評估胭脂紅酸清除自由基的能力，并與抗壞血酸清除3種自由基的能力做比較。結果顯示：胭脂紅酸與抗壞血酸對3種自由基：DPPH自由基、ABTS+·及O2－·均具有清除活性；當胭脂紅酸達到一定質量濃度時，對DPPH自由基、ABTS+·及O2－·的清除率分別可達83%、85%及46.84%左右。結果表明胭脂紅酸是一種對自由基具有一定清除活性的食品添加劑。

胭脂紅酸；抗壞血酸；自由基；清除活性

胭脂紅酸(也稱洋紅酸)是雌性胭脂蟲成蟲體內產生的一種天然蒽醌類色素。胭脂蟲(Dactylopius coccus Costa)是寄生在仙人掌上的一類經濟昆蟲，原產于拉丁美洲。我國本無胭脂蟲天然分布，本世紀初由中國林業科學研究院資源昆蟲研究所引入我國，并在我國西南地區成功繁育[1-2]。胭脂紅酸約占胭脂蟲干蟲體質量的17%～24%[3]，是(美國)食品及藥物管理局(FDA)允許既可用于食品又可用于醫藥品和化妝品的染色劑[4]，有研究表明，胭脂紅酸對因致癌物導致的DNA損傷也有明顯的修復作用，并可用于病毒性疾病(如水皰性口炎、皰疹性口炎等)、癌癥和艾滋病的防治[5-6]。

自由基具有高度的化學活性，是人體生命活動中多種生化反應的中間代謝產物。正常情況下，人體自身自由基代謝處于動態平衡狀態。若由于各種原因，人體自由基產生過多或自身的抗氧化體系受到影響，體內自由基代謝就會失去平衡，導致構成生物膜的磷脂過氧化，引發一系列疾病，如衰老、心臟病、動脈粥樣硬化等[7-10]。這時攝入一些自由基清除物，對維持體內自由基平衡，防治疾病，保持機體健康有積極作用。許多與胭脂紅酸結構相似的蒽醌類化合物如大黃酸和蘆薈大黃酸都具有抗氧化活性或清除自由基的功能[11-14]。胭脂蟲引入我國后，國內學者對胭脂紅酸的提取、精制加工及分析檢測進行了較為系統的報道[15-20]。但就胭脂紅酸清除自由基的活性，目前國內未見報道。因此，本研究以3種不同的自由基為實驗對象，評估胭脂紅酸清除自由基的活性，并與已知具有較強自由基清除活性的抗壞血酸作比較，評估胭脂紅酸清除自由基的能力，以期為胭脂紅酸的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胭脂紅酸(純度100%) 三榮源株式會社；抗壞血酸(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH自由基) Sigma公司；2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS) (100%) EMD 生物科技有限公司；連苯三酚(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷 上海伯奧生物科技有限公司；過硫酸鉀(分析純) 天津市化學試劑三廠；無水乙醇(分析純) 上海化學試劑總廠；鹽酸(分析純) 重慶川東化工(集團)有限公司化學試劑廠；純水實驗室自制。

1.2 儀器與設備

DU 800紫外-可見分光光度計 美國Beckman Coulter公司；CPC-505斯瑪特專業pH/電導/離子/溶解氧測定儀 斯瑪特公司；AB204-S精密型電子天平 Mettler Toledo中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 胭脂紅酸與抗壞血酸清除DPPH自由基活性的測定

配制質量濃度為39.40μg/mL的DPPH自由基乙醇溶液；配制適當質量濃度的胭脂紅酸水溶液和抗壞血酸水溶液。按下式計算胭脂紅酸或抗壞血酸的自由基清除率[21]。

胭脂紅酸對自由基清除率 /%=(1－ACAi/ACA0)×100抗壞血酸對自由基清除率/%=(1－AVCi/AVC0)×100式中：ACA0為DPPH自由基乙醇溶液和純水混合液的吸光度與胭脂紅酸溶液和乙醇混合液的吸光度之和；ACAi為DPPH自由基乙醇溶液與胭脂紅酸溶液混合液的吸光度。AVC0為DPPH自由基乙醇溶液與純水混合液的吸光度；AVCi為DPPH自由基乙醇溶液與抗壞血酸溶液混合液的吸光度。以上混合液均為等體積比混合，波長517nm處測吸光度，每個樣品重復3次實驗，取平均值。

1.3.2 胭脂紅酸與抗壞血酸清除ABTS+·的活性測定

配制ABTS質量濃度為3836μg/mL與過硫酸鉀質量濃度為676μg/mL的混合液，常溫下暗室反應16h，將此溶液稀釋50倍待用。配制適當質量濃度的胭脂紅酸水溶液和抗壞血酸水溶液。按下式計算胭脂紅酸和抗壞血酸的ABTS+·清除率[21]：

式中：A0為ABTS+·溶液與等體積純水等體積混合液的吸光度；ACAi和AVCi分別表示ABTS+·溶液加等體積胭脂紅酸水溶液或抗壞血酸溶液，5min內每隔0.25min測得的吸光度；以上檢測波長為734nm，每個樣品重復3次實驗，取平均值。

1.3.3 胭脂紅酸與抗壞血酸清除O2－·的活性測定

配制質量濃度為126μg/mL的連苯三酚水溶液，并滴加1～2滴0.1mol/L的鹽酸；配制適當質量濃度的胭脂紅酸溶液和抗壞血酸溶液；配制pH8.2左右的Tris-HCl緩沖液。按下式計算胭脂紅酸和抗壞血酸的自由基清除率[22]。

式中：F0=A0i/t；FCAi=ACAi/t；FVCi=AVCi/t；t表示時間。A0i為Tris-HCl緩沖液2mL、純水與連苯三酚溶液各1mL的混合液吸光度；ACAi為Tris-HCl緩沖液2mL、胭脂紅酸溶液與連苯三酚溶液各1mL的混合液吸光度；AVCi為Tris-HCl緩沖液2mL、抗壞血酸水溶液與連苯三酚溶液各1mL的混合液吸光度。10min內每隔0.5min在波長318nm處測吸光度，每個樣品重復3次實驗，取平均值。

1.3.4 胭脂紅酸與抗壞血酸清除自由基能力的比較

分別以胭脂紅酸與自由基質量比mCA/mDPPH自由基、mCA/mABTS和mCA/mPA，以抗壞血酸與自由基質量比mVC/mDPPH自由基、mVC/mABTS和mVC/mPA為橫坐標，自由基清除率為縱坐標，作變化曲線，曲線斜率VCA和VVC表示胭脂紅酸和抗壞血酸清除自由基的能力。

2 結果與分析

2.1 胭脂紅酸與抗壞血酸清除DPPH自由基活性

圖1 不同質量濃度胭脂紅酸清除DPPH自由基的曲線Fig.1 DPPH radical scavenging curves of carminic acid at various concentrations

圖2 不同質量濃度抗壞血酸清除DPPH自由基的曲線Fig.2 DPPH radical scavenging curves of ascorbic acid at various concentrations

DPPH自由基是一種穩定的以氮為中心的有機質子自由基，易溶于乙醇，溶液呈紫色，在517nm波長處有強吸收，若有自由基清除劑存在并與其發生反應，使其褪色，則波長517nm處的吸光度減小，減小程度與自由基清除程度呈線性關系。雖然DPPH自由基并非人體內產生的自由基，但對DPPH自由基的清除能力仍可有效的評價抗氧化劑的抗氧化活性。

胭脂紅酸和抗壞血酸清除DPPH自由基活性結果見圖1、2。胭脂紅酸在質量濃度在4.50～22.50μg/mL、抗壞血酸質量濃度在1.51～7.53μg/mL的范圍內，對DPPH自由基清除能力隨著質量濃度遞增而逐漸增強。當胭脂紅酸和抗壞血酸質量濃度分別達到22.50、7.53μg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到83%左右，即清除了溶液中絕大部分的自由基。

按1.3.4節方法計算胭脂紅酸和抗壞血酸的清除自由基能力，VCA為132.14，VVC為401.84。胭脂紅酸清除DPPH自由基的能力相當于抗壞血酸的33%左右。表明胭脂紅酸對DPPH自由基具有一定的清除能力。

2.2 胭脂紅酸與抗壞血酸清除ABTS+·活性

圖3 不同質量濃度胭脂紅酸清除ABTS+·的曲線Fig.3 ABTS+radical scavenging curves of carminic acid at various concentrations

圖4 不同質量濃度抗壞血酸清除ABTS+·的曲線Fig.4 ABTS+radical scavenging curves of ascorbic acid at various concentrations

從圖3、4可以看出，胭脂紅酸和抗壞血酸與ABTS+·的反應速度均很快。胭脂紅酸水溶液及抗壞血酸水溶液質量濃度分別在3.75～18.75μg/mL和3.02～15.10μg/mL的范圍內，對ABTS+·的清除率隨著質量濃度增大而增大。當胭脂紅酸水溶液質量達到18.75μg/mL時；對ABTS+·的清除率超過85%，抗壞血酸質量濃度達到15.10μg/mL時，對ABTS+·的清除率超過97%，即清除了溶液中絕大部分的自由基。

按1.3.4節的方法比較胭脂紅酸和抗壞血酸清除自由基的能力，VCA為346.77，VVC為529.33。胭脂紅酸清除ABTS+·的能力約為抗壞血酸的66%左右。表明胭脂紅酸對ABTS+·具有較強的清除能力。

2.3 胭脂紅酸與抗壞血酸清除O2－·活性

連苯三酚在酸性條件下較穩定，有堿性Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液)緩沖液存在的條件下，連苯三酚迅速自氧化，自氧化過程中產生O2－·，O2－·同時加速連苯三酚自氧化的速率，同時生成中間產物，中間產物在波長320nm左右有強吸收，中間產物積累越多，吸收越強[23]。由于自氧化的速率依賴于O2－·的濃度，清除O2－·就能抑制自氧化的速率，阻止中間產物的積累。因此，可以根據波長320nm左右吸光度變化速率，推斷中間產物積累速率，進一步推斷O2－·被清除的程度，從而評估目標物對O2－·的清除活性。本研究中，通過掃描此堿性系統中自氧化產物的吸收光譜，發現波長318nm處有最大吸收，因此選擇318nm為檢測波長。

圖5 不同質量濃度胭脂紅酸清除O2－·的曲線Fig.5 Superoxide anion radical scavenging curves of carminic acid at various concentrations

圖6 不同質量濃度抗壞血酸清除O2－·的曲線Fig.6 Superoxide anion radical scavenging curves of ascorbic acid at various concentrations

胭脂紅酸及抗壞血酸存在的條件下，連苯三酚在堿性條件下產生自由基速率的情況見圖5、6。按1.3.3節方法計算自由基的清除率，見表1。胭脂紅酸水溶液及抗壞血酸水溶液質量濃度分別在30.00～150.00μg/mL和17.68～88.40μg/mL的范圍內，對O2－·的清除率隨著質量濃度增大而增大。當胭脂紅酸水溶液質量濃度為30.00

μg/mL時，對O2－·幾乎沒有清除作用，當達到150.00μg/mL時，對O2－·的清除率約為46.84%。抗壞血酸質量濃度達到88.40μg/mL時，對O2－·的清除率超過98%，即清除了溶液中絕大部分的自由基。

表1 兩種自由基清除劑質量濃度與清除率之間的關系Table 1 Concentration dependence of superoxide anion radical scavenging ratios of carminic acid and ascorbic acid

根據1.3.4節的方法計算得，VVC為49.58，VCA為156.25，胭脂紅酸清除O2－·的能力約為抗壞血酸的32%左右。表明胭脂紅酸對O2－·具有清除活性。

3 結 論

3.1 胭脂紅酸對DPPH自由基具有一定的清除活性，當胭脂紅酸質量濃度達到22.50μg/mL時，對溶液中DPPH自由基的清除率可以達到83%左右。

3.2 胭脂紅酸對ABTS+·具有較強的清除能力，當質量濃度達到18.75μg/mL時，胭脂紅酸能夠清除溶液中85%左右ABTS+·。

3.4 胭脂紅酸清除DPPH自由基、ABTS+·和O2－·三種自由基的能力分別相當于抗壞血酸的33%、66%和32%。

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Free Radical Scavenging Capacity of Carminic Acid

GUO Yuan-heng，MA Li-yi，ZHENG Hua，ZHANG Hong*，GAN Jin，LI Kun
(Key Laboratory of Cultivation and Utilization of Resource Insects, State Forestry Administration, Research Institute of Resource Insects, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China)

In order to evaluate the ability of carminic acid to scavenge DPPH, ABTS+and superoxide anion radicals, the absorbance changes of the solutions of these three free radicals at certain characteristic wavelengths before and after addition of this acid were measured. Meanwhile, comparison among scavenging activities of carminic acid against these three free radicals was carried out. Carminic acid at certain concentrations could scavenge all of these free radicals and presented scavenging ratios of around 83%, 85% and 46.84% against DPPH, ABTS+and superoxide anion radicals, respectively. This investigation reveals that carminic acid has certain free radical scavenging activity, thereby providing a food additive.

carminic acid；ascorbic acid；free radicals；scavenging activity

TS202.3；S899.3

A

1002-6630(2010)17-0073-04

2010-06-13

科技部成果轉化項目(2007GB24320425)；國家林業科技成果推廣項目([2010]11)

郭元亨(1984—)，碩士研究生，主要從事天然資源化學與利用研究。E-mail：gyh2905030235@sina.com

*通信作者：張弘(1963—)，男，研究員，學士，主要從事林業生物資源化學與利用研究。E-mail：kmzhhong@163.com