沙棘籽粕生物堿的提取分離及對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

胡長(zhǎng)鷹，徐德平

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

沙棘籽粕生物堿的提取分離及對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

胡長(zhǎng)鷹1，徐德平2

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

目的：研究沙棘籽粕中生物堿的提取分離及其對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。方法：用乙醇提取、利用多種柱層析分離手段從沙棘籽粕中分離單體化合物，采用質(zhì)譜、核磁共振法鑒定其結(jié)構(gòu)；采用乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷模型，利用MTT法測(cè)定心肌細(xì)胞存活率，檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)含量以反映心肌細(xì)胞受損的程度。結(jié)果：從沙棘籽粕分離得到SJ-A-Ⅰ組分，經(jīng)鑒定為生物堿5,11-二羥基色胺；該物質(zhì)能有效維持心肌細(xì)胞活力，減少培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷所致心肌酶(LDH、CK)的釋放。結(jié)論：沙棘籽粕中的生物堿5,11-二羥基色胺對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用，其最佳質(zhì)量濃度為150mg/L。

沙棘籽粕；生物堿；5,11-二羥基色胺；心肌細(xì)胞；缺血/再灌注

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)是胡頹子科沙棘屬植物，我國(guó)沙棘資源蘊(yùn)藏量豐富，主要分布在西北、西南、華北和東北等地[1]。沙棘籽含有豐富的脂肪酸、蛋白質(zhì)和生物活性物質(zhì)，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前沙棘籽主要用來(lái)提取沙棘油，脫油后的籽粕大多作為飼料[2-3]。據(jù)報(bào)道沙棘籽粕中含有大量的具有多種生理活性的原花青素，因此對(duì)沙棘籽粕中原花青素的研究已成熱點(diǎn)[4-7]。

本課題組在對(duì)沙棘籽粕中原花青素組成的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，沙棘籽粕中除原花青素外還含有大量的生物堿。對(duì)生物堿的主要組分進(jìn)一步分離，得到一個(gè)生物堿單體并確定該生物堿的結(jié)構(gòu)。以體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞為基礎(chǔ)，通過缺氧/復(fù)氧復(fù)制心肌缺血/再灌注模型，探討沙棘籽粕中生物堿對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘(Hippophae rhamnoides L. subsp. Sinensis Rousi)籽粕為沙棘籽經(jīng)超臨界CO2萃取后的籽粕，購(gòu)自青海省康普生物公司。

無(wú)水乙醇、丙酮、硫酸、茴香醛、冰醋酸、甲醇、石油醚(沸程30～60℃)、正丁醇(均為AR級(jí)) 上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站；GF254硅膠板 山東煙臺(tái)芝罘化工廠；大孔吸附樹脂AB-8 南開大學(xué)化工廠；MCI gelCHP20柱填料 日本三菱化學(xué)公司；HW-40柱填料日本Tosoh公司；95%工業(yè)乙醇 市購(gòu)。

SD乳鼠：1～3d，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK粵2006-0015)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS) 美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶 美國(guó)Hyclone公司；噻唑蘭(MTT) 美國(guó)Amresco 公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒 東甌津瑪生物科技有限公司；肌酸激酶(CK)試劑盒 奧斯邦生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WFJ8-20中藥粉碎機(jī) 江陰市靈杏藥化設(shè)備有限公司；SS800離心機(jī) 江蘇華大離心機(jī)制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；循環(huán)水真空泵、低溫冷卻液循環(huán)泵 鞏義市英峪予華儀器廠；質(zhì)譜儀ESI/MS 英國(guó)Micromass公司； 500MHz核磁共振儀Buker Avance公司；CO2培養(yǎng)箱 Thermo Forma公司；CKX41倒置顯微鏡 Olympus公司；96孔板 廣東光華化學(xué)廠；低溫恒溫離心機(jī) Eppendorf公司；酶標(biāo)儀Tecan公司；7600全自動(dòng)生化分析儀 Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘籽生物堿的提取與分離

將50kg沙棘籽粕置于500L提取罐中，以體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇為溶劑，料液比1∶5(m/V)，50℃攪拌提取2h，1200r/min離心15min分離出乙醇液，渣再重復(fù)提取2次。合并清液，濃縮到約1/10體積。濃縮液邊攪拌邊加入2～3倍體積乙酸乙酯進(jìn)行萃取，反復(fù)多次萃取，直至乙酸乙酯相無(wú)色時(shí)止。合并乙酸乙酯相，在低于55℃條件下減壓濃縮至無(wú)乙酸乙酯味，得沙棘籽乙酸乙酯萃取物。

將乙酸乙酯萃取物上大孔吸附樹脂(型號(hào)AB-8)層析柱(20cm×180cm)，先用1倍柱體積去離子水洗脫，再用20%乙醇洗脫，收集20%乙醇洗脫液，濃縮到無(wú)乙醇止。置于真空干燥箱內(nèi)，控制溫度50～60℃，干燥3 h，得沙棘籽總生物堿。

將總生物堿溶解，上HW-40柱(50mm×1500mm)，先用2000mL去離子水洗脫，再用5%、10%、15%、2 0%不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇梯度洗脫，每梯度洗脫1000mL，20mL收集一試管，經(jīng)TLC鑒定和硫酸茴香醛顯色，將Rf值和顯色情況相同的洗脫液合并，選擇其中包含含量最高成分的洗脫部分合并濃縮。將該部分濃縮液反復(fù)上MCI柱(35mm×1000mm)，分別用去離子水、5%、10%乙醇洗脫，每梯度洗脫500mL，洗脫流速5.0mL/min，20mL收集1管，經(jīng)TLC鑒定純度，得到單體化合物SJ-A-Ⅰ。

1.3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

將SJ-A-Ⅰ用重水(D2O)溶解后進(jìn)行1H-NMR、13CNMR、135DEPT測(cè)定。

1.3.3 SJ-A-Ⅰ對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷的影響

1.3.3.1 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[8-10]的方法：將出生1～3d的SD乳鼠20只于75%酒精中浸泡10s后取出心臟，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去血液，取出心尖1/3左右，反復(fù)洗3次，剪碎，加入0.125%胰蛋白酶8mL消化，于37℃水浴中磁力攪拌5min，自然沉淀后去除上清液，再加入8mL胰蛋白酶反復(fù)消化，取上清液移入10mL離心管中，加等量含血清培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)，800r/min離心7min。將離心所得的沉淀用含血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，200目過濾，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置二氧化碳培養(yǎng)箱(體積分?jǐn)?shù)為95% O2，5% CO2)中差速貼壁2.5h，純化心肌細(xì)胞。當(dāng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù)達(dá)95%以上時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度4×104個(gè)/孔接種于96孔板。置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換1次液，48h后再換液。待細(xì)胞融合，狀態(tài)良好，出現(xiàn)同簇細(xì)胞同步搏動(dòng)時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 實(shí)驗(yàn)分組

取培養(yǎng)3～4d的心肌細(xì)胞，分5組：正常對(duì)照組；缺血/再灌注模型組；SJ-A-Ⅰ50、100、150、200mg/L劑量給藥組。

1.3.3.3 心肌缺血/再灌注損傷模型建立

按文獻(xiàn)[11]配制模擬缺血液，缺血液充入氮?dú)?純度99%)飽和15min，置換正常培養(yǎng)基后，放入自制密封盒內(nèi)，充氮10min后密封，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，造成心肌細(xì)胞缺血缺氧。再灌注時(shí)以復(fù)氧液置換缺血液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。

1.3.3.4 檢測(cè)指標(biāo)

采用MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率[8]；采用LDH(乳酸脫氫酶)、CK(肌酸激酶)含量的高低反映心肌細(xì)胞受損的程度(采用試劑盒進(jìn)行檢測(cè))。

1.3.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0版統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，

用單因素方差分析比較各組均數(shù)之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 SJ-A-Ⅰ結(jié)構(gòu)的鑒定

SJ-A-Ⅰ為白色無(wú)定形粉末，溶于甲醇、乙醇，易溶于水。ESI-MS給出m/z：178.3[M+H]+，SJ-A-Ⅰ相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)為177.3，從相對(duì)分子質(zhì)量為奇數(shù)來(lái)看，SJ-A-Ⅰ應(yīng)含奇數(shù)個(gè)氮原子。

1H-NMR譜：芳香區(qū)有4個(gè)氫，其中δ7.23(1H，d，J=8.7)，6.99(1H，d，J=2.3)，6.76(1H，dd，J=2.3，8.7)，這3個(gè)氫形成一個(gè)AMX系統(tǒng)，表明存在苯環(huán)鄰間位三取代；δ7.05為單峰氫。δ3.72(2H，d, J=6.9)，2.80(2H，d, J=6.9)，從偶合常數(shù)來(lái)看應(yīng)為相連的兩個(gè)C H2。

13C-NMR譜和135DEPT譜：共有10個(gè)C，其中δ 134.5、130.7、113.9為3個(gè)季碳，δ127.4、115.4、114.4、105.8為4個(gè)－CH上的碳，δ64.8、30.4為2個(gè)－C H2上的碳。從化學(xué)位移看δ64.8為一個(gè)連氧的－CH2，推斷有－CH2CH2OH結(jié)構(gòu)片斷。綜合分析并參照文獻(xiàn)[12-13]得SJ-A-Ⅰ為5,11-二羥基色胺，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 5,11-二羥基色胺結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of 5,11-dihydroxyltryptamine

2.2 SJ-A-Ⅰ對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷的影響

2.2.1 SJ-A-Ⅰ對(duì)缺血/再灌注損傷乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響

表1 SJ-A-Ⅰ對(duì)缺血/再灌注損傷乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響(x±s)Table 1 Effect of SJ-A-Ⅰ on viability of neonatal rat cardiomyocytes injured by I/R (x±s)

由表1可見，在模型組中其細(xì)胞存活率僅為27.55%，可見缺血/再灌注明顯損傷心肌細(xì)胞活力，SJ-A-Ⅰ能有效提高細(xì)胞存活率，并呈明顯的量效關(guān)系。SJ-A-Ⅰ劑量為50mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率為58.26%(P＜0.05)，SJ-A-Ⅰ劑量為150mg/L時(shí)，心肌細(xì)胞存活率高達(dá)85.67% (P＜0.01)，但在200mg/L時(shí)心肌細(xì)胞存活率反而有所下降。實(shí)驗(yàn)表明SJ-A-Ⅰ具有很強(qiáng)的保護(hù)心肌細(xì)胞作用，最佳質(zhì)量濃度在150mg/L。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示高質(zhì)量濃度生物堿SJ-A-Ⅰ對(duì)心肌細(xì)胞是否有一定負(fù)面作用，課題組正在進(jìn)一步研究中。

2.2.2 SJ-A-Ⅰ對(duì)缺血/再灌注損傷心肌細(xì)胞液中LDH、CK含量的影響

LDH、CK是細(xì)胞能量代謝過程中重要的催化酶，當(dāng)心肌細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞膜破裂后可從細(xì)胞內(nèi)釋放。培養(yǎng)液中LDH、CK的含量越高反映心肌細(xì)胞受損的程度越重。S J-A-Ⅰ對(duì)缺血/再灌注損傷心肌細(xì)胞液中LDH、CK含量的影響如表2所示。

表2 SJ-A-Ⅰ對(duì)缺血/再灌注損傷心肌細(xì)胞中LDH和CK含量的影響(x±s)Table 2 Effect of SJ-A-Ⅰon LDH and CK activities of neonatal rat cardiomyocytes injured by I/R (x±s)

由表2可見，在模型組中可見缺血/再灌注損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞液中LDH、CK含量顯著升高，達(dá)到23.71%，表明心肌細(xì)胞受損嚴(yán)重。沙棘籽粕提取物SJ-A-Ⅰ能有效降低細(xì)胞液中LDH和CK含量，劑量為50mg/L時(shí)就能顯著降低LDH和CK含量(P＜0.05)，在150mg/L時(shí)LDH、CK含量最低(P＜0.01)，并且呈劑量依賴關(guān)系。表明SJ-A-Ⅰ對(duì)缺血/再灌注造成的心肌細(xì)胞損傷具有有效保護(hù)作用，150mg/L效果最好。

3 結(jié) 論

沙棘是我國(guó)古代藏醫(yī)、蒙醫(yī)的常用藥物。1977年，沙棘作為中藥被列入《中華人民共和國(guó)藥典》。目前沙棘活性成分研究多集中在沙棘油、黃酮、原花青素等，有關(guān)沙棘籽粕中生物堿的成分和活性的研究，國(guó)內(nèi)外少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從沙棘籽粕中分離得到生物堿類物質(zhì)5,11-二羥基色胺，具有類似血清素(5-羥基色胺)的

結(jié)構(gòu)，而這類化學(xué)物質(zhì)具有很好的保護(hù)心血管疾病作用[14]，乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷的保護(hù)研究表明，沙棘抗心肌缺血活性除黃酮、原花青素外生物堿也起著重要作用。同時(shí)，高質(zhì)量濃度生物堿5,11-二羥基色胺對(duì)心肌細(xì)胞是否有一定負(fù)面作用，課題組正在進(jìn)一步研究中。

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Extraction, Isolation and Protective Effect of Alkaloid from Seabuckthorn Seeds on Injured Cardiomyocytes in Rats

HU Chang-ying1，XU De-ping2
(1. Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Objective∶ To investigate the protective effect of alkaloid from seabuckthorn seeds on injured cardiomyocytes in rats. Methods∶ EtOH extract from seabuckthorn seeds was purified by column chromatography and its structure was elucidated by MS and NMR spectroscopic analyses. A model of cardiac ischemic/reperfusion (I/R) in vitro was established using the primary cultured rat cardiomyocytes. The viability of cardiomyocytes was evaluated by MTT assay and the contents of lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) were measured to verify the protective effect on injured rat cardiomyocytes by I/R. Results∶ The structure of water-soluble alkaloid was identified as 5,11-dihydroxyltryptamine, which could promote the survival rate of cardiomyocytes subjected to I/R injury and reduced the release of myocardial enzymes induced by I/R injury. Conclusion∶ The identified 5,11-dihydroxyltryptamine from seabuckthorn seeds exhibited an excellent protective effect on cultured neonatal rat cardiomyocytes injured by ischemia/reperfusion at the optimal concentration of 150 mg/L.

seabuckthorn seed；alkaloid；5,11-dihydroxyltryptamine；cardiomyocyte；ischemia/reperfusion

R282.7

A

1002-6630(2010)09-0234-04

2009-09-19

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD83B02)

胡長(zhǎng)鷹(1968—)，女，副教授，博士，主要從事食品功能因子和農(nóng)副產(chǎn)品深加工研究。E-mail：hucy0000@sina.com