醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕的條件優(yōu)化

邵元龍， 董 英*

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕的條件優(yōu)化

邵元龍， 董 英*

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

采用響應(yīng)面法對(duì)醬油曲霉固體發(fā)酵芝麻餅粕提高抗氧化能力的條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)法，評(píng)價(jià)麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麥麩、玉米漿、酵母膏和硫酸銨8個(gè)因素對(duì)清除DPPH自由基能力的影響。篩選出麥麩、葡萄糖和硫酸銨為影響芝麻餅粕發(fā)酵提取物抗氧化活性的3個(gè)顯著因素，然后采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，對(duì)3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的發(fā)酵條件為：葡萄糖、硫酸銨和麥麩添加量分別為1.87%、1.54%和2.55%。在該實(shí)驗(yàn)條件下，DPPH自由基清除活性為80.26%。

芝麻餅粕；發(fā)酵；優(yōu)化；抗氧化活性；醬油曲霉

在亞洲國(guó)家，芝麻廣泛應(yīng)用在各種傳統(tǒng)食品中，并且是世界上重要的油料作物之一，我國(guó)2007年的產(chǎn)量已達(dá)到59萬(wàn)t。芝麻種子中除含有50%的油和25%的蛋白外，還含有豐富的具有生理活性的物質(zhì)[1]。提油后的芝麻餅粕中蛋白含量進(jìn)一步提高，部分具有活性的木脂素類(lèi)物質(zhì)也殘留在芝麻餅粕中。這部分木脂素包括芝麻素、芝麻酚、芝麻林素、芝麻林素酚等[2]。他們?cè)隗w內(nèi)或體外具有不同的生理活性，如：抑制Δ 5去飽和酶[3]、保護(hù)肝臟[4]、降低膽固醇[5]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[6]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)芝麻餅粕中抗氧化物質(zhì)的研究日趨深入[7-8]，如對(duì)芝麻素的提取工藝[9-10]、檢測(cè)方法[11]的研究。單純的分離和鑒定木脂素已不能滿(mǎn)足未來(lái)對(duì)抗氧化劑的需求，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)方法來(lái)尋找新的抗氧化劑來(lái)源是較有前景的途徑之一。2003年，日本的Ohtsuki等[12]用環(huán)狀芽孢桿菌YUS-2液體發(fā)酵芝麻餅粕，發(fā)現(xiàn)兩種新的具有更強(qiáng)抗氧化能力的物質(zhì)。2005年，日本的Miyake等[13]采用Aspergillus分別發(fā)酵芝麻素和三糖基芝麻素酚，轉(zhuǎn)化生成了更強(qiáng)抗氧化活性的木脂素類(lèi)物質(zhì)。

2007年，董英等[14]用醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕，發(fā)現(xiàn)可以提高其抗氧化活性，但并未對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。因此，本實(shí)驗(yàn)選用醬油曲霉(Aspergillus soja e)對(duì)芝麻餅粕進(jìn)行發(fā)酵，以抗氧化活性(DPPH自由基清除活性)為指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為對(duì)發(fā)酵芝麻餅粕中抗氧化物質(zhì)的提取、分析和轉(zhuǎn)化機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

醬油曲霉(CICC2128) 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；芝麻餅粕 江蘇鎮(zhèn)江京友調(diào)味品公司。

二苯代苦味肼基自由基(2,2-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH) 美國(guó)Sigma公司。

HH-S恒溫水浴鍋、JJ-1 型電動(dòng)攪拌器 江蘇金壇醫(yī)療儀器廠；LD5-10離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；WFJ-72000可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；YM50A電熱蒸汽壓力滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；PSX智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波來(lái)福科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

醬油曲霉接種于土豆汁(PDA)斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72h后，加入10mL無(wú)菌生理鹽水，用接種針刮下，調(diào)節(jié)菌液濃度為0.86×108CFU/mL。將粉碎的芝麻餅粕在烘箱中烘干，按料液比為1∶3(g/mL)的比例加入正己烷，45℃水浴攪拌3h，4000r/min離心10min，得脫脂芝麻餅粕。取10g烘干的脫脂芝麻餅粕加入9mL溶解有不同成分的溶液，于121℃滅菌20min，冷卻后，接種1mL制備好的種子懸液，搖勻，于28℃條件下發(fā)酵144h。

根據(jù)醬油曲霉生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)要素的基本原則和發(fā)酵影響因素的一般規(guī)律，結(jié)合文獻(xiàn)[14]的報(bào)道和前期的實(shí)驗(yàn)，選用試驗(yàn)次數(shù)n=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)麥芽糖(A)、葡萄糖(B)、蔗糖(D)、果糖(E)、麥麩(G)、玉米漿(H)、酵母膏(K)和硫酸銨(L)8個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素取兩個(gè)水平，設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1，響應(yīng)值為發(fā)酵提取液對(duì)DPPH自由基清除活性(radical scanvening activity，RSA)。另設(shè) 3個(gè)虛擬列，以考察實(shí)驗(yàn)誤差。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出各因素的F值和可信度水平。一般選擇可信度大于90%以上的因素作為重要因素。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design

1.2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，選取醬油曲霉固體發(fā)酵芝麻餅粕提取液對(duì)DPPH自由基清除活性影響顯著的外界因子：葡萄糖、麥麩和硫酸銨作為試驗(yàn)因素。試驗(yàn)中響應(yīng)值為DPPH自由基清除活性，試驗(yàn)因素隨機(jī)編碼為：葡萄糖(X1)、硫酸銨(X2)和麥麩(X3)，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，發(fā)酵條件與Plackett-Burman試驗(yàn)一致。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 發(fā)酵液的提取

發(fā)酵結(jié)束后，每瓶加入體積分?jǐn)?shù)8 0%乙醇溶液75mL，50℃水浴攪拌提取2h，轉(zhuǎn)速150r/min。上清液于5000r/min離心10min。沉淀按同樣條件重復(fù)提取一次，合并上清液，定容至150mL。

1.4 DPPH自由基清除活性測(cè)定

取發(fā)酵提取液1mL，用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液稀釋10倍，作為樣品液。DPPH溶液濃度為7.5×10-6mol/L，波長(zhǎng)517nm，50%乙醇溶液為對(duì)照。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定兩次，求平均值。DPPH自由基清除活性(RSA)按下式計(jì)算：

式中： A0為5mL DPPH與1mL乙醇混合液的吸光度；Ai為5mL DPPH與1mL樣品反應(yīng)后的吸光度；Aj為5mL乙醇與1mL樣品混合液的吸光度[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

Plackett-Burman設(shè)計(jì)法是一種兩水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它基于非完全平衡塊原理，可以用最少試驗(yàn)次數(shù)估計(jì)出因素的主效應(yīng)，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素，供進(jìn)一步研究用。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出各因素的 F值和可信度水

平。一般選擇可信度大于 90%以上的因素作為重要因素[16]。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果相關(guān)系數(shù)和方差分析Table 4 Regression coefficients and variance analysis for the results of Plackett-Burman experiments

由表4各因素效應(yīng)分析結(jié)果可知，經(jīng)過(guò)醬油曲霉發(fā)酵后，葡萄糖、麥麩和硫酸銨3個(gè)因素對(duì)提取液清除DPPH自由基影響顯著，可信度在90%以上，對(duì)此三因素進(jìn)一步做響應(yīng)面試驗(yàn)。而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小，正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表5，利用Desig-Expert 7.0軟件，對(duì)表5中數(shù)據(jù)回歸擬合，獲得Aspergillus發(fā)酵芝麻餅粕的提取物抗氧化能力對(duì)自變量葡萄糖、硫酸銨和麥麩的二次多項(xiàng)回歸方程：

RSA/%=78.31＋2.22X1＋0.84X2＋2.27X3－0.39X1X2＋0.48X1X3＋0.32X2X3－1.77X12－2.76X22－2.06X32

模型方差分析見(jiàn)表6，試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性(P=0.0229)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.0569)，其校正系數(shù)R2=0.926，表明有約92.6%的抗氧化能力可由此模型進(jìn)行解釋。所以自由基清除率與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，可用于Aspergillus固體發(fā)酵提高抗氧化能力的分析和預(yù)測(cè)。3個(gè)試驗(yàn)因素中X1和X3對(duì)發(fā)酵提取物清除DPPH自由基能力的影響極顯著，而硫酸銨與各因素的交互作用皆不顯著。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of Box-Behnken experiments

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

圖1 葡萄糖和硫酸銨交互作用的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.1 Three-dimension respose surface plot for mutual interaction between glucose and ammonium sulfate

由圖1可知，當(dāng)葡萄糖和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%時(shí)，RSA最低。硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，隨葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，RSA也逐漸上升；硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)，隨葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，RSA提高顯著。當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)再增高時(shí)，RSA隨葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大是先提高后下降趨勢(shì)。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，RAS是先增大后減小。說(shuō)明該氮源對(duì)RSA的變化范圍適當(dāng)。

圖2 葡萄糖和麥麩交互作用的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.2 Three-dimension respose surface plot for mutual interaction between ammonium sulfate and wheat bran

由圖2 可知，RSA隨著葡萄糖和麥麩質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高而提高。其原因可能是因?yàn)槠咸烟菫檩^好的碳源，一方面促進(jìn)了醬油曲霉的生長(zhǎng)，間接地提高了生物作用的效果。麥麩富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在促進(jìn)生物生長(zhǎng)的同時(shí)，還提高了芝麻餅粕的通氣狀況。

圖3 硫酸銨和麥麩交互作用的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.3 Three-dimension respose surface plot for mutual influence between ammonium sulfate and wheat bran

由圖3可知，硫酸銨和麥麩交互作用可知，麥麩含量一定時(shí)，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，RSA是先上升后下降，并且高于1.5%時(shí)，變化更趨于明顯。當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%～1.75%時(shí)，RSA隨麥麩質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高變化較明顯，在2.5%左右達(dá)到最大值，總趨勢(shì)為隨著麥麩質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，RSA為先增加后降低，此點(diǎn)說(shuō)明了麥麩對(duì)RSA的影響并不重要，由此也排除了發(fā)酵麥麩提高RSA占主導(dǎo)作用的可能。

2.4 模型驗(yàn)證

表7 模型驗(yàn)證Table 7 Verification of the model

為驗(yàn)證醬油曲霉固體發(fā)酵提高抗氧化能力模型方程的合適性和有效性，在葡萄糖、硫酸銨和麥麩試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，選擇性地進(jìn)行了5組不同組合的實(shí)際驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(表7)，同時(shí)以未發(fā)酵的芝麻餅粕做對(duì)照。利用 SPSS (version14.0)軟件對(duì)表7中數(shù)據(jù)進(jìn)行距離相關(guān)分析得知，自由基清除活性實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)為0.865，證明此模型是合適有效的，并具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。選擇1號(hào)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的因素組合作為優(yōu)化的結(jié)果，即葡萄糖1.87%、硫酸銨1.54%、麥麩2.55%，該條件下，芝麻餅粕發(fā)酵提取物實(shí)際DPPH自由基清除活性為80.26%，明顯優(yōu)于未發(fā)酵的對(duì)照組。

3 結(jié) 論

3.1 用Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化醬油曲霉固體發(fā)酵芝麻餅粕提高抗氧化能力的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型方程為：RSA/%=78.31＋2.22X1＋0.84X2＋2.27X3－0.39X1X2＋0.48X1X3＋0.32X2X3－1.77X12－2.76X22－2.06X32，且該方程的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相關(guān)系為0.865，符合程度高，具有一定的指導(dǎo)意義。根據(jù)方程優(yōu)化的參數(shù)，獲得較優(yōu)的發(fā)酵條件為：葡萄糖、硫酸銨和麥麩質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：1.87%、1.54%和2.55%，在該條件下發(fā)酵，DPPH自由基清除率為80.26%，未發(fā)酵的對(duì)照為42.78%。

3.2 通過(guò)對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的等高線圖和曲面圖分析，認(rèn)為添加的麥麩主要是提高了通氣效果，排除了抗氧化活性提高受其較大影響的可能。單獨(dú)發(fā)酵麥麩，是否

具有效提高抗氧化的作用，還有待進(jìn)一步探索。

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Optimization of Nutritional Supplements for Fermentation Medium based on Sesame Cake for the Production of Antioxidant Substances by Aspergillus sojae

SHAO Yuan-long，DONG Ying*
(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Response surface methodology was used to optimize fermentation condition to improve antioxidant activity in solidstate sesame cake by Aspergillus sojae. The effects of maltose, glucose, sucrose, fructose, wheat bran, corn steep, yeast extract and ammonium sulfate on scavenging capability of sesame cake to DPPH free radicals were evaluated by using Plackett-Burman design. Results showed that wheat bran and glucose as well as ammonium sulfate were the major factors and had significant effect on antioxidant activity. Meanwhile, the central composite experimental design and response surface analysis were used to optimize the levels of major factors. The optimal condition was 1.87% glucose, 1.54% ammonium sulfate and 2.55% wheat bran, respectively. Under this optimal fermentation condition, the scavenging capability of sesame cake to DPPH free radicals was 80.26%.

sesame cake；fermentation；optimization；antioxidant activity；Aspergillus sojae

TQ92

A

1002-6630(2010)09-0192-05

2009-01-09

江蘇省科技攻關(guān)項(xiàng)目(BE2005335)

邵元龍(1977— )，男，博士，主要從事生物資源的深度開(kāi)發(fā)與利用研究。E-mail：long9702@126.com

*通信作者：董英(1954 —)，女，教授，本科，主要從事食品功能因子和食品生物技術(shù)研究。E-mail：ydong@ujs.edu.cn