米根霉不同菌絲體形態對重復間歇發酵生產L-乳酸的影響

鄭 志，杜 威，姜紹通*，吳學鳳，李興江，羅水忠，張任遠

(合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

米根霉不同菌絲體形態對重復間歇發酵生產L-乳酸的影響

鄭 志，杜 威，姜紹通*，吳學鳳，李興江，羅水忠，張任遠

(合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

研究米根霉在3L發酵罐重復間歇發酵過程中，菌體形態對發酵強度的影響。結果表明：絮狀米根霉首批發酵產L-乳酸為105.8g/L，葡萄糖轉化率88.12%，球狀米根霉產L-乳酸105.0g/L，葡萄糖轉化率87.50%；在重復間歇發酵過程中，球狀米根霉前6批產L-乳酸均保持在80.00g/L以上，第7批產L-乳酸78.60g/L，葡萄糖轉化率均高于87.33%，產酸效率最高可達到4.26g/(L·h)，而絮狀米根霉前4批產L-乳酸可保持在80.00g/L以上，第5批產L-乳酸78.30g/L，第6批產L-乳酸77.40g/L，第7批產L-乳酸70.20g/L，產酸效率最高可達4.07g/(L·h)。研究數據顯示，球狀米根霉更適于重復間歇發酵生產L-乳酸。

L-乳酸；米根霉；形態；重復間歇發酵

L-乳酸是一種重要的天然有機酸，在食品、醫藥、生物降解塑料的制造上有廣泛應用[1]。L-乳酸經聚合作用生成生物可降解塑料聚L-乳酸，可以解決大量廢棄塑料所造成的環境污染問題，對于農副產品深加工及環境保護都具有重要的意義[2-4]。米根霉以其營養要求粗放，菌絲體大而易于分離，L-乳酸純度高，易于精制，有利于工業化生產高純度的L-乳酸，成為國內外廣泛采用發酵生產的菌種[5]。

米根霉深層發酵生產L-乳酸過程中，菌體表現出多樣的形態，主要有絮狀體、菌球、塊狀聚結物[6]。不同的菌體形態，其發酵效率有很大區別。Yu等[7]在發酵過程中通過補充硫酸氨控制米根霉保持絮狀形態，達到109.0g/L，產酸效率2.73g/(L·h)。Kosakai等[8]在米根霉培養液中加入無機載體和聚乙烯氧化物形成菌絲絮凝體，L-乳酸的產量為103.6g/L，產酸效率1.70g/(L·h)。Park等[9]利用此種絮狀體在氣升式反應器中發酵生產

L-乳酸，L-乳酸的產量為104.6g/L，產酸效率1.80g/(L·h)。Liu等[10]通過優化發酵條件得到球狀菌體，L-乳酸的產量為92.00g/L，產L-乳酸效率0.70g/(L·h)。Bai等[11]通過控制米根霉的發酵條件使其為菌球形，在大大降低發酵液黏度的同時，產L-乳酸達到76.10g/L，產酸效率2.11 g/(L·h)。Zhou等[12]研究一種小球體形態的米根霉在泡罩塔反應器中的發酵特性，產酸效率為2. 58g/(L·h)。塊狀的菌體形態在發酵過程中接種量難于控制，且極大限制了菌體內部的傳氧、傳質，產物產量明顯偏低，一般不選用[13]。正是由于米根霉發酵過程中菌體形態不同，影響了發酵過程中傳質、溶氧等性能，致使發酵效率有很大不同。

本實驗在確定絮狀米根霉及球狀米根霉最優發酵條件基礎上，對比研究絮狀米根霉和球狀米根霉在重復間歇發酵生產L-乳酸過程中的發酵狀態，穩定性及產酸效率，以期為米根霉重復間歇發酵生產L-乳酸的工業化實施提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

米根霉AS3.819，保藏在PDA培養基上，每兩個月轉接一次斜面。孢子由PDA培養基產生，用無菌蒸餾水洗下孢子制成懸液。

1.1.2 培養基

菌種保藏斜面培養基：馬鈴薯葡萄糖培養基(P D A)。

絮狀米根霉發酵培養基(g/L)：葡萄糖1 2 0、(NH4)2SO43.00、KH2PO40.10、MgSO4·7H2O 0.25、ZnSO4·7H2O 0.05、NaH2PO40.25、CaCO360.00。

球狀米根霉發酵培養基(g/L)：葡萄糖1 2 0、(NH4)2SO43、KH2PO40.15、MgSO4·7H2O 0.2 5、ZnSO4·7H2O 0.25、NaH2PO40.15、CaCO360。

間歇補料培養基(g/L)：葡萄糖 90、(NH4)2SO43、KH2PO40.075、MgSO4·7H2O 0.35、 ZnSO4·7H2O 0.22、CaCO345。

1.2 方法

1.2.1 斜面培養

將斜面置于32℃霉菌培養箱，培養時間3d。

1.2.2 發酵罐培養

3L發酵罐裝入2L的培養液，121℃滅菌15min，接種，發酵溫度32℃，發酵罐壓力0.05MPa，絮狀米根霉攪拌速率200r/min，球狀米根霉攪拌速率400r/min，培養40～55h。

1.2.33 L發酵罐半連續發酵

首批發酵結束后停止攪拌，5min后，球狀米根霉沉降于發酵罐底部，15min后，絮狀米根霉沉降于發酵罐底部。通氣使發酵罐保壓在0.1MPa左右，通過壓力將發酵液從取料裝置壓出總發酵液體積的4/5，加入滅菌后的間歇補料培養基，繼續發酵，發酵期間參數控制同1.2.2節。

產酸效率按式(1)計算。

所有實驗平行重復3次，實驗結果取平均值。

1.2.4 檢測方法

L-乳酸含量測定：高效液相色譜校正的EDTA定鈣法[14]；還原糖測定：3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)[15]；生物量測定：菌體干質量法[16]。

2 結果與分析

2.1 米根霉發酵生產L-乳酸的菌體形態研究

米根霉在上述成絮狀和球狀菌絲體的發酵條件下培養48h，分別取其菌絲體，并進行顯微觀察，結果見圖1、2。

圖1 球狀米根霉(a)和絮狀米根霉(b)形態Fig.1 Morphology ofRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form

圖 2 球狀米根霉(a)(×100)和絮狀米根霉(b)(×400)在顯微鏡下形態Fig.2 Micrograph ofRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form

由圖1可看出，球狀菌絲體大小較均一，小球直徑1mm左右；絮狀菌絲體則為乳白色棉絮狀。圖2顯微觀察可知，絮狀菌體菌絲粗壯，無自溶現象，處于生長旺盛期；球狀菌體菌球中心菌絲致密，而邊緣較為松散，屬松散型菌球。文獻[13]報道此兩種米根霉菌體形態均可正常高效發酵生產L-乳酸。

2.2 米根霉發酵生產L-乳酸的動力學研究

2.2.1 首批發酵動力學

測定發酵液中的米根霉生物量、葡萄糖質量濃度和L-乳酸質量濃度，即研究菌體生長、糖代謝和產酸的動力學，結果見圖3。

圖 3 首批球狀米根霉(a)和絮狀米根霉(b)發酵動力學曲線Fig.3 Kinetic curves of fermentations byRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form during the first batch fermentation

由圖3a可以看出，發酵初期的12h，L-乳酸和生物量很少，即菌體生長與生產緩慢，處于生長階段的延滯期；18h至52h，菌體迅速增長的同時L-乳酸質量濃度也隨之迅速增加，這段時間是米根霉生長與生產旺盛時期，處于對數生長期；52h后乳酸質量濃度基本保持穩定，生物量變化不大，發酵進入穩定期。圖3b顯示結果基本與圖3a相同，發酵初期的18h菌體生長與生產緩慢，24h至48h是米根霉生長與生產旺盛期，48h后進入穩定期。

綜合圖3可以得出，絮狀米根霉與球狀米根霉進入穩定期后產L-乳酸和生物量相當，球狀米根霉和絮狀米根霉產酸分別為105.0g/L和105.8g/L，生物量分別為8.055g/L和8.202g/L。球狀米根霉首批發酵36～42h，L-乳酸對基質得率最大為2.914g/g，而絮狀米根霉首批發酵48～52h，L-乳酸對基質得率最大為2.893g/g，由此可知，首批發酵中，球狀米根霉和絮狀米根霉發酵效率基本相同。

2.2.2 重復批次發酵動力學

首批發酵結束后，分別使球狀和絮狀米根霉菌絲體自然沉降于發酵罐底部。通過壓力將發酵液排出4/5后，再加入補料培養基進行重復批次的發酵。分別測定了第3批和第6批發酵液中的葡萄糖質量濃度和L-乳酸質量濃度，即研究糖代謝和產酸的動力學，結果見圖4、5。

圖4 第3批球狀米根霉(a)和絮狀米根霉(b)發酵動力學曲線Fig.4 Kinetic curves of fermentations byRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form during the 3rdbatch fermentation

圖5 第6批球狀米根霉(a)和絮狀米根霉(b)發酵動力學曲線Fig.5 Kinetic curves of fermentations byRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form during the 6thbatch fermentation

由圖4可以看出，第3批時，球狀米根霉發酵19h即達到發酵終點，葡萄糖質量濃度為1.90g/L；絮狀米霉發酵20h達到發酵終點，葡萄糖質量濃度為2.10g/L。

由圖5可以看出，第6批時，球狀米根霉和絮狀米根霉均發酵24h達到發酵終點，葡萄糖質量濃度分別為2.10g/L和 3.20g/L。數據顯示，球狀米根霉和絮狀米根霉在第6批發酵時，發酵時間均較第3批長，剩余葡萄糖質量濃度均較第3批含量高，說明球狀米根霉和絮狀米根霉的產酸效率隨批次的增加而下降。

球狀米根霉和絮狀米根霉在重復間歇發酵生產L-乳酸過程中糖耗和產酸都基本趨于線性，無延滯期。這是因為米根霉細胞在首批發酵主體已增殖完畢，形成了菌絲體在后續重復批次的發酵中，繼續發酵轉化葡萄糖為L-乳酸。這樣，既減少了碳源用于生物量擴增的消耗，提高了原料葡萄糖轉化率，又極大縮短了發酵周期，從而實現提高發酵強度的目的。本研究結果也表明，絮狀米根霉和球狀米根霉都符合重復間歇發酵的特點，二者均可重復間歇發酵生產L-乳酸。

2.3 米根霉菌體形態對重復間歇發酵生產L-乳酸穩定性的影響

在上述重復批次發酵中，每批次均取樣檢測L-乳酸產量并計算產酸效率，結果見圖6、7。

圖 6 米根霉形態對重復間歇發酵穩定性的影響Fig.6 Effect ofRhizopus oryzaemorphology on stability of repeated intermittent fermentation

圖 7 米根霉形態對重復間歇發酵產酸效率的影響Fig.7 Effect ofRhizopus oryzaemorphology on fermentation efficiency of repeated intermittent fermentation

由圖6可知，球狀米根霉在前6批產L-乳酸質量濃度均保持在80.00g/L以上，葡萄糖轉化率高于88.80%，在第7批時略有下降但均高于87.33%；而絮狀米根霉前4批可保持在80.00g/L以上，第5批開始下降，且至第7批時下降趨勢尤為明顯。

由圖7可知，重復間歇發酵批次中，球狀米根霉產酸效率最高為4.26g/(L·h)，絮狀米根霉產酸效率最高為4.07g/(L·h)。且在各批次產酸效率比較中，球狀米根霉均高于絮狀米根霉。

綜合圖6、7可知，球狀米根霉的穩定性優于絮狀米根霉。結合圖4、5中重復間歇發酵批次的動力學發現，絮狀米根霉和球狀米根霉均可重復間歇發酵生產L-乳酸，但球狀米根霉在重復間歇發酵批次中，產酸效率高，穩定性好，相對絮狀米根霉而言，更適合重復間歇發酵。

3 結 論

3.1 首批罐發酵絮狀米根霉產L-乳酸105.8g/L，葡萄糖轉化率88.12%，球狀米根霉產L-乳酸105.0g/L，葡萄糖轉化率87.50%。

3.2 重復間歇發酵批次中，球狀米根霉前6批產L-乳酸均保持在80.00g/L以上，葡萄糖轉化率高于88.89%，產L-乳酸速率最高可達到4.26g/(L·h)，在第7批時產L-乳酸略有下降，為78.60g/L，葡萄糖轉化率為87.33%；絮狀米根霉前4批產L-乳酸可保持在80.00g/L以上，產L-乳酸速率最高可達4.07g/(L·h)，在第5批時產酸開始下降，至第7批時產L-乳酸僅為70.20g/L，葡萄糖轉化率為78.00%。

3.3 米根霉重復間歇發酵生產L-乳酸過程中，菌體形態對其生長狀態，產酸效率和穩定性有很大的影響，相對于絮狀米根霉，球狀米根霉具有穩定性好，產酸效率高的優點，故球狀米根霉更適于重復間歇發酵生產L-乳酸。

[1]佟明友, 方向晨, 劉樹臣, 等. L-乳酸和聚乳酸的研究進展[J]. 石油化工, 2003, 32(8)∶ 724-728.

[2]王博彥, 金其榮. 發酵有機酸生產與應用手冊[M]. 北京∶ 中國輕工業出版社, 2000∶ 33-39.

[3]YIN P M, NISHINA N, KOSAKAI Y. Enhence production of L(+)-lactic acid from corn starch in a culture of Rhizopus oryzae using an air-lift Bioreactor[J]. J Ferment Bioeng, 1997, 84(3)∶ 249-253.

[4]YU R C, HANG Y D. Kinetics of direct fermentation of agricultural commodities to L(+)-lactic acid by Rhizopus oryzae[J]. Biotechnol Lett, 1989, 11(8)∶ 597-600.

[5]趙宏宇, 趙靖, 鄭春麗, 等. 米根霉乳酸發酵的研究進展[J]. 天津化工, 2007, 21(1)∶ 7-9.

[6]白冬梅, 趙學明, 李鑫鋼, 等. 米根霉發酵生產L(+)-乳酸研究進展

[J]. 現代化工, 2002, 22(6)∶ 9-13.

[7]YU Meiching WANG Ronchi,WANG Chungyih, et al. Enhanced production of L(+)-lactic acid by floc-form culture of Rhizopus oryzae[J]. Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers, 2007, 38(3/4)∶223-228.

[8]KOSAKAI Y, PARK Y S, OKABE M. Enhancement of L(+)-lactic acid production using mycelial flocs of Rhizopus oryzae[J]. Biotechnol Bioeng, 1997, 55(3)∶ 461-470.

[9]PARK Y S, KOSAKAI Y, OKABE M. Efficient production of L(+)-lactic acid using mycelial catton-like flocs of Rhizopus oryzae in an airlift bioreactor[J]. Biotechnol Prog, 1998, 14(5)∶ 699-704.

[10]LIU Yan, LIAO Wei, LIU Chuanbin, et al. Optimization of L(+)-lactic acid production using pelletized gilamentous Rhizopus oryzae NRRL359 [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2006,131(1/3)∶ 844-853.

[11]BAI Dongmei, JIA Minze. L(+)-lactic acid production by pellet-form Rhizopus oryzae R1021 in a stirred tank fermentor[J]. Chemical Engineering Science, 2003, 58(3/6)∶ 785-791.

[12]ZHOU Y, DOMINGUEZ J M, CAO N. Optimization of L(+)-lactic acid production from glucose by Rhizopus oryzae ATCC 52311[J]. Appl Biochem Biotechnol, 1999, 78(1/3)∶ 401-407.

[13]徐晴, 黃和, 李霜, 等. 深層發酵中絲狀真菌菌球形態控制的策略[J].食品科技, 2009, 34(2)∶ 13-17.

[14]鄭志, 姜紹通, 潘麗軍, 等. EDTA定鈣法測定發酵液中乳酸含量的探討[J]. 食品科學, 2003, 24(3)∶ 102-105．

[15]陳毓荃. 生物化學試驗方法和技術[M]. 北京∶ 科學出版社, 2002∶ 83-86.

[16]賈士儒. 生物工藝與工程實驗技術[M]. 北京∶ 中國輕工業出版社, 2002∶ 1-4.

Effect of Mycelia Morphology of Rhizopus oryzae on Repeated Intermittent Fermentation of L-lactic Acid

ZHENG Zhi，DU Wei，JIANG Shao-tong*，WU Xue-feng，LI Xing-jiang，LUO Shui-zhong， ZHANG Ren-yuan
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The effect of Rhizopus oryzae strain on fermentation intensity of L-lactic acid during repeated intermittent fermentation in a 3 L fermentor were investigated. Results demonstrated that the yields of L-lactic acid were 105.8 g/L and 105.0 g/L through in the first batch fermentation by Rhizopus oryzae strain in flocs-form and pellet-form, and glucose conversion rates were 88.12 % and 87.50%, respectively. The average yield of L-lactic acid fermentation through Rhizopus oryzae strain in pellet-form was more than 80.00 g/L during the first 6 repeated intermittent fermentations. The glucose conversion rate was higher than 87.33%, and the highest L-lactic acid productivity was 4.26 g/(L·h). However, the yield of L-lactic acid was decreased to 78.60 g/L in the 7th batch fermentation. The average yield of L-lactic acid fermentation through Rhizopus oryzae strain in flocs-form was more than 80.00 g/L during the first 4 repeated intermittent fermentations. But the yield of L-lactic acid was decreased to 78.30, 77.40 g/L and 70.20 g/L in the following 3 batches of fermentation. The highest productivity for L-lactic acid reached up to 4.07 g/(L·h).

L-lactic acid；Rhizopus oryzae；morphology；repeated intermittent fermentation

TQ921. 3

A

1002-6630(2010)09-0166-05

2009-09-02

國家“863”計劃重點項目(2007AA10Z361)

鄭志(1971—)，男，副教授，博士，研究方向為農產品加工及貯藏工程。E-mail：zhengzhi@hfut.edu.cn

*通信作者：姜紹通(1954—)，男，教授，博士，研究方向為農產品資源綜合利用。E-mail：jianshaotong@yahoo.com.cn