黑木耳提取物對細菌群體感應及生物膜形成的抑制作用

李 斌，董明盛*

(南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

黑木耳提取物對細菌群體感應及生物膜形成的抑制作用

李 斌，董明盛*

(南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

采用報告菌平板法檢測黑木耳甲醇粗提物對細菌群體感應現象的抑制作用，同時，采用微孔板法和菌落計數法研究黑木耳粗提物對大腸桿菌Escherichia coli 8099生物膜形成的影響。結果表明：黑木耳粗提物能有效抑制大腸桿菌生物膜的形成，0.3g/mL黑木耳粗提物的抑制率可以達到72.16%。

細菌群體感應；黑木耳；生物膜；抑制

“群體感應”(quorum-sensing，QS)[1]是指細菌的數量(quorum)達到一定的密度時才能發生的感應現象(sensing)。當一個特定環境中的細菌數量增加時，由細菌的LuxⅠ蛋白所合成的信息分子的濃度也會相應的升高，當信號分子積累到一定的濃度后，就能和細胞質中信號分子的受體蛋白相結合，引起受體蛋白構象變化，進一步激活靶基因的表達，展現出新的行為特征，比如生物發光、毒性基因的表達、質粒轉移、細菌的群游和生物膜的形成等[2]。

細菌生物膜是指由附著于惰性或者活性實體表面的細菌細胞和包裹著細菌的水合性基質所組成的結構性細菌群落[3]。現已證明，很多久治不愈的慢性細菌性感染與生物膜有關。細菌可在人體組織如牙齒、皮膚、肺、尿道及其他器官的表面形成生物膜，引起諸如肺囊性纖維化，彌漫性泛細支氣管炎，牙周炎，膽道感染，心瓣膜性心內膜炎等[4-5]。細菌能黏附大多數醫療器械的材料表面并形成生物膜，如靜脈導管、導尿管、氣管插管、人工心臟瓣膜、隱型眼鏡等[6-7]。此外，生物膜細菌還可污染與人類生活相關的供水系統、空調系統和食品加工設備等，由此造成傳染病的流行[8-9]。據估計，大約65%人類細菌性感染是由生物膜細菌引起的。群體感應抑制劑在降低細菌致病力的同時，又不會致使細菌產生抗藥性，因此利用它來控制生物膜的形成引起了人們廣泛的關注。

黑木耳(Auricularia auricular)隸屬真菌門、擔子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬，是著名藥食兼用真菌。子實體除含有豐富的蛋白質、纖維素等營養物質外，還含有豐富的B族維生素以及鈣、磷、銅等有益元素。黑木耳多糖還具有抗腫瘤、抗血栓、抗衰老、降血糖、降血脂、調節免疫等功能[10]。從木耳子實體中分離的黑刺菌素(adustin)有抗真菌作用。我國是世界上主要的黑木耳生產國，人工栽培起源于我國，年產

量占世界總產量的90%以上，它在我國多數地區都有生產，已有1000多年記載歷史。深入研究黑木耳的主要活性功能成分，探索其對人類的有益作用，具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及其特性

紫色桿菌(C. violaceum CV026)由美國德克薩斯州立大學McLean J C教授惠贈，是野生菌株Chromobacterium violaceum ATCC 31532的mini-Tn5突變體，卡那霉素抗性，用量為20μg/mL，本身不產生AHLs，也不產生紫色，當外源AHLs存在時，回復產生特征性紫色，C. violaceum CV026的CviR對側鏈長度為C4到C8的AHLs不同程度的敏感[11-12]。該菌株在LB培養基中28℃搖床培養。

Escherichia coli 8099本實驗室保存，在LB培養基中37℃培養。

1.2 試劑與設備

卡那霉素、C6-HSL 美國Sigma公司。

RE-5299旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 樣品處理

攔水壩的修建反映了當地人民有抵御自然災害的意識和修建防御工程的聰明才智，反映了少數民族應對復雜自然環境所具備的獨特的智慧。

市購黑木耳子實體(產地黑龍江綏陽)，經35℃恒溫烘干24h，粉碎，過40目篩，取10g粉末，加入乙酸乙酯40mL，靜置提取24h后，過濾除去殘渣，濾液經旋轉蒸發儀蒸干(真空度0.1kPa，溫度30℃)，再用2mL的甲醇重懸，重懸液經0.22μm的有機膜過濾除菌，－20℃保藏，備用[13]。

1.4 報告菌平板法檢測(quorum sensing inhibition，QSI)和抑菌實驗

報告菌CV026過夜活化兩次后，按體積分數2%的比例接種10mL新鮮的LB培養基，120r/min，28℃培養至OD600nm為1.0，與100mL含有40μmol/L的AHL信號分子C6-HSL和0.8g/100mL瓊脂的LB培養基混合，傾注平板，凝固后，采用平板擴散法[14]，每個濾紙片上點樣5μL粗提物，對照為5μL甲醇。2 8℃過夜培養。抑菌實驗時固體培養基中不添加AHL信號分子，其余同上。

1.5 粗提物對Escherichia coli 8099生物膜形成的影響

1.5.1 微孔板法

該法參考199 9年O'To ole等[15]提出的方法。Escherichia coli ATCC8099活化兩次后，按體積分數1%接種新鮮的LB培養基，96孔板每個孔內加入的物質和量見表1，對照為甲醇，每個樣品及對照做3個平行樣，37℃培養24h后，移去孔內培養液，用蒸餾水清洗3～ 5次，用125μL質量分數為0.3%的結晶紫染色15min，用蒸餾水清洗3～5次，去除孔內多余的染料，再加入200μL 95%乙醇溶解出結合于生物膜上的結晶紫，每個孔內移取125μL到另一96孔板內，酶標儀測定吸光度(595nm)。

1.5.2 菌落計數法

2 結果與分析

2.1 QSI檢測和抑菌作用

C. violaceum CV026紫色素的產生受群體感應現象的調控，若樣品提取物中含有QS抑制劑，其將抑制C. violaceum CV026產生紫色，在濾紙片周圍就會出現白色、渾濁不透明的抑制圈，黑木耳的甲醇粗提物會產生這種特異性的抑制圈。對其進行抑菌實驗，結果見圖1，發現黑木耳粗提物沒有抑制圈的產生，說明黑木耳的粗提物中有能干擾群體感應的物質的存在。從圖2可以看出，隨著粗提物質量濃度的降低，這種抑制圈的直徑也在隨之減少。對溶劑甲醇進行檢測，發現其未含有QSI作用和抑菌作用。

圖1 樣品粗提物對C.violaceumCV026產紫色素的抑制作用Fig.1 Inhibition effect ofAuricularia auricularextract on violacein production

圖2 樣品粗提物對C.violaceumCV026生長的抑制作用Fig.2 Inhibition effect ofAuricularia auricularextract onC. violaceumCV026

為了驗證樣品粗體物是否對C. violaceum CV026的生長有抑制作用，用滅菌后的小棉棒輕觸如圖2的小圓紙片周圍的白色抑制圈，然后點樣在LB固體培養基上培養，結果見圖3。

因為黑木耳提取物溶解于甲醇中，為了測定黑木耳提取物對Escherichia coli 8099生物膜形成的影響，甲醇作為陽性對照。本實驗還做了未添加甲醇和粗提物的對照。黑木耳粗提物以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g/mL的質量濃度加入到E. coli 8099培養基中，結果如表1所示。

從表1可以看出，隨著粗提物質量濃度的升高，對生物膜形成的抑制率也逐漸升高，當菌液中黑木耳粗提物的質量濃度達到0.6g/mL時，其對生物膜形成的抑制率達到50.23%。微孔板法是一種傳統方法[17-18]，為了驗證實驗結果，同時采用了菌落計數法。

2.3 菌落計數法

該法通過直接計算生物膜內的活菌數來對生物膜進行量化。甲醇做為對照，黑木耳粗提物以0.1、0.2、0.3g/mL的質量濃度加入到E. coli 8099培養基中，結果見表2。從圖3可以看出，圖2的小圓紙片周圍確實生長有菌落，黑木耳粗體物并沒有抑制C. violaceum CV026的生長，而只是抑制了紫色桿菌素的產生。

圖3 抑菌實驗的驗證實驗Fig.3 Verification experiments of antibacterial disk assay

2.2 微孔板法

表1 黑木耳提取物對生物膜形成的影響(微孔板法)Table 1 Effect of extract fromAuricularia auricularon biofilm formation evaluated by ninety-six-well plate assay

表2 黑木耳提取物對生物膜形成的影響(菌落計數法)Table 2 Effect of extract fromAuricularia auricularon biofilm formation evaluated by colony count assay

從表2可以看出，隨著黑木耳提取物質量濃度的提高，其對E. coli 8099生物膜形成的抑制能力也在逐漸提高。0.3g/mL的粗提物質量濃度對生物膜的抑制率是72.16%。由于PVC小片和96孔板的材料形狀不同，加上操作也不同，所以就同一菌株生物膜實驗得出結果有所差異應屬正常。

3 討 論

很多腐敗細菌是通過群體感應來調控腐敗形狀的表達從而影響食品的品質。因此，通過降解或者是失活信號分子來控制腐敗是目前一個非常熱點的研究領域。同時也為食品的防腐保鮮開創了新途徑。這種防腐策略與傳統的防腐技術不同，它是通過阻斷細菌細胞之間的通信，使其不產生腐敗行為，不產生細菌毒素，但并不影響細胞的生長。這種防腐措施不會導致抗藥性產生，從原來的“肉搏戰”轉變為“信息戰”。已經證明來源于海洋紅藻Delisea pulchra的鹵化呋喃酮化合物10～20μg/mL(此質量濃度不會影響到菌體的生長)通過

與AHL受體蛋白競爭結合而抑制V. fischeri和V. Harveyi的生物發光現象，抑制率可達到50～100倍。同時還以濃度依賴的方式抑制S. liquefaciens的浮游現象。另外，其他的高等植物包括豇豆、番茄、野豌豆、苜蓿和水稻也可分泌QSI，影響細菌AHL介導的QS調控系統。但是目前發現的大部分群體感應抑制劑存在一個問題，它們具有一定的毒性不適于在人類生活中應用。比如，鹵代呋喃酮和其衍生物雖有較強的干擾QS信號通路的活性，卻有一定的誘變致癌作用[19-20]。因此，尋找新的來源的QSI就顯得越來越重要。

本實驗證明黑木耳粗提物可以干擾C.violaceum CV026的群體感應現象，但是不影響C. violaceum CV026的生長。大腸桿菌生物膜的形成也受群體感應的調控，之后又研究了黑木耳提取物對Escherichia coli 8099生物膜形成的影響。發現其確實減弱了生物膜的形成，并且影響程度受黑木耳提取物的質量濃度的影響，隨著質量濃度的降低，受抑制程度隨之降低。在我國，黑木耳作為一種食品和藥品已經有幾個世紀的歷史，黑木耳粗提物或者從中分離到的一些特殊化合物可能被人類用于控制或抑制有害生物膜形成的新型抑制劑。此外，為了能將黑木耳粗提物應用于食品領域，其成分以及成分結構需要進一步的研究。

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Inhibition Effect of Extract from Auricularia auricular on Quorum Sensing and Biofilm Formation of Bacteria

LI Bin，DONG Ming-sheng*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Methanol-soluble compounds were extracted from Auricularia auricular to investigate the inhibition effect on quorum sensing through agar plate assays. The inhibition effect of extract from Auricularia auricular on biofilm formation of Escherichia coli 8099 was evaluated through ninety-six-well plate biofilm assay and disk reactor biofilm experiments. Approximately 72.16% inhibition rate on biofilm formation was observed in Auricularia auricular extract at the concentration of 0.3 g/mL.

quorum sensing；Auricularia auricular；biofilm；inhibition

TS201.3

A

1002-6630(2010)09-0140-04

2009-12-11

國家自然科學基金項目(30700627)；江蘇省農業科技自主創新項目(CX(08)113)

李斌(1984—)，女，博士研究生，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：binbin27_lee@163.com

*通信作者：董明盛(1961—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：dongms@njau.edu.cn