胸腺切除術(shù)后應(yīng)用免疫抑制劑治療重癥肌無力的分析研究

乞國艷 鄭旭光 楊紅 郄春菊 張?zhí)?劉慈 顧姍姍

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是神經(jīng)肌肉接頭處傳遞功能障礙的疾病，是由乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)、T細(xì)胞依賴、補(bǔ)體參與的自身免疫性疾病，細(xì)胞免疫免疫調(diào)節(jié)異常是本病的重要的發(fā)病機(jī)制之一［1，2］。我們利用流式細(xì)胞儀檢測2組MG患者的外周血T細(xì)胞亞群CD+4CD+25Tr細(xì)胞的百分率和乙酰膽堿受體抗體(AchR-Ab)濃度，動(dòng)態(tài)觀察2組在治療前和治療后6個(gè)月的變化，應(yīng)用許氏臨床評(píng)分法［3］觀察MG患者病情嚴(yán)重程度和評(píng)價(jià)臨床療效，以探討MG患者細(xì)胞免疫和免疫調(diào)節(jié)的變化及其與臨床療效的相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2004年11月到2009年11月入住我院的MG患者69例，均根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)、新斯的明試驗(yàn)陽性和肌電圖確診MG;并進(jìn)行有關(guān)檢查排除了并發(fā)甲狀腺功能亢進(jìn)癥等其他自身免疫性疾病。隨機(jī)分為A、B 2組，A組34例，B組35例。2組患者一般情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 2組一般情況比較ˉx±s

1.2 方法

1.2.1 臨床治療方法:A組先行胸腺切除，切除后1個(gè)月左右應(yīng)用甲基潑尼松龍(15～20 mg/kg)沖擊治療，逐漸遞減方式，伍用硫唑嘌呤2 mg/kg和補(bǔ)中益氣中藥口服。B組胸腺切除術(shù)后未用免疫抑制劑，只給予抗膽堿酯酶劑和補(bǔ)中益氣中藥口服。應(yīng)用許氏臨床評(píng)分法［1］觀察2組病情嚴(yán)重程度和評(píng)價(jià)臨床療效。

1.2.2 標(biāo)本采集與方法

1.2.2.2 乙酰膽堿受體抗體檢測定方法:酶聯(lián)免疫吸附法①包被:用α-銀環(huán)蛇毒素(1 mg/ml)10 μl+包被液 10 ml，每孔100μl，24 h 4℃保存，PBS-T洗3次，每次3 min。②加入乙酰膽堿受體:每支乙酰膽堿受體干粉加蒸餾水0.4 ml混勻。再1∶100稀釋備用。10 μl(1∶10 R)+10 ml PBS-T混勻，每孔100μl，37℃ 1 h。PBS-T洗3次，每次3 min。③血清及乙酰膽堿受體抗體工作標(biāo)準(zhǔn):患者血清或倍倍稀釋的乙酰膽堿受體抗體工作標(biāo)準(zhǔn)夜，每孔100μl，37℃ 30 min，PBS液洗3次，每次3 min。④結(jié)合物:辣銀過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人LgG結(jié)合物，每支溶于0.5 ml蒸餾水中。取其溶解物30μl結(jié)合物加15 ml PBS-T 混勻，每孔每孔100 μl，37℃ 30 min，PBS液洗3 次，每次3 min。⑤ 底物:鄰苯二胺4 mg+底物緩沖液10 ml+3%過氧化氫15μl(用時(shí)現(xiàn)配每孔100μl，暗處37℃ 5 min。⑥終止2 mol/L H2SO4，每孔50μl。⑦測定OD值490 nm波長下測定OD值。

1.2.3 臨床計(jì)分及療效判定:分別在2組治療前、后6個(gè)月應(yīng)用絕對(duì)計(jì)分法記錄MG患者受累肌群肌無力和易疲勞的嚴(yán)重程度，用臨床相對(duì)計(jì)分法來做病情的比較和療效判定。臨床相對(duì)計(jì)分=(治療前臨床絕對(duì)計(jì)分－治療后絕對(duì)積分)/治療前臨床絕對(duì)計(jì)分 ×100%［1］。痊愈:95% ～100%;基本痊愈:80% ～94%;顯效:50% ～79%;好轉(zhuǎn):25% ～49%;無效:0。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，經(jīng)正態(tài)及方差齊性檢驗(yàn)后，計(jì)量資料以ˉx±s表示，采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，臨床療效比較采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療后6個(gè)月2組CD+4CD+25Tr細(xì)胞百分率和AchR-Ab濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

表2 2組免疫抑制劑治療后6個(gè)月CD+4 CD+25 Tr細(xì)胞百分率和AchR-Ab濃度變化比較ˉx±s

2.2 A組 相對(duì)積分在50%以上的患者32例，占總?cè)藬?shù)94.1%;50%以下的患者2例占5.9%。B組:相對(duì)積分在50%以上的患者20例，占總?cè)藬?shù)57.1%，50%以下的患者15例占42.9%。2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 2組治療后6個(gè)月臨床療效比較 例(%)

3 討論

MG是一種影響神經(jīng)肌肉接頭傳遞的自身免疫性疾病，其確切的發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，但是有關(guān)該病的研究還是很多的，其中，研究最多的是有關(guān)MG與胸腺的關(guān)系，以及乙酰膽堿受體抗體在MG中的作用，MG患者神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上的乙酰膽堿受體(AchR)數(shù)目減少，受體部位存在抗AchR抗體，且突觸后膜上有IgG和C3復(fù)合物的沉積。并且證明，血清中的抗AchR抗體的增高和突觸后膜上的沉積所引起的有效的AchR數(shù)目的減少，是MG發(fā)生的主要原因［1］。而胸腺是AchR抗體產(chǎn)生的主要場所，因此，MG的發(fā)生一般與胸腺有密切的關(guān)系。胸腺來源的調(diào)節(jié)性CD+4CD+25Tr(調(diào)節(jié)性)細(xì)胞數(shù)目或功能的異常是MG發(fā)生的扳機(jī)。幾乎所有的MG患者有胸腺異常(＞90%)，而CD+4C+25T(Tr)細(xì)胞由胸腺產(chǎn)生后輸出至外周，并通過主動(dòng)調(diào)節(jié)(dominant regulation)的方式抑制存在于正常機(jī)體內(nèi)潛在的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化與增殖，從而防止自身免疫性疾病的發(fā)生［3］。研究提示，CD+4C+25Tr細(xì)胞的數(shù)量減少或功能異常均有可能導(dǎo)致自身免疫病的發(fā)生［4］。本研究2組在治療后6個(gè)月CD+4CD+25Tr細(xì)胞百分率、AchR-Ab濃度和臨床緩解率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明MG患者胸腺切除術(shù)后應(yīng)用免疫抑制劑治療6個(gè)月AchR-Ab濃度明顯低于未用免疫抑制劑組，CD+4CD+25Tr細(xì)胞百分率和臨床緩解率明顯高于未用免疫抑制劑組。因此，當(dāng)機(jī)體接受外來致病因子的侵襲時(shí)，抑制性CD+4CD+25Tr細(xì)胞和致病性CD+4CD－25Tr的比例將決定自身免疫反應(yīng)的起始、程度和病程［5］。對(duì)于病情未能很好控制的MG患者來說，因其體內(nèi)不能產(chǎn)生足夠量的CD+4CD+25Tr細(xì)胞來抑制大量激活的自身反應(yīng)性T細(xì)胞，AchR-Ab產(chǎn)生增多，疾病就遷延、加重、以至惡化;而當(dāng)機(jī)體能產(chǎn)生足夠量的CD+4CD+25Tr細(xì)胞來對(duì)抗自身反應(yīng)性T細(xì)胞時(shí)，AchR-Ab產(chǎn)生減少，MG病情就趨于穩(wěn)定或緩解［6］。

1 龔非力主編.醫(yī)學(xué)免疫學(xué).第1版.北京:科學(xué)出版社，2005.1-4，164-168.

2 乞國艷，張獻(xiàn)波，鄭旭光，等.重癥肌無力胸腺切除術(shù)后復(fù)發(fā)放射治療12 例.河北醫(yī)藥，2009，31:3282.

3 許賢豪主編.肌無力.第1版.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2003.24-120.

4 李呂力，李曉峰.重癥肌無力的免疫發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)展.廣西醫(yī)學(xué)，2008，30:858-861.

5 Balandina A，lecart S，Dartevelle P，et al.Functional defect of regulatory CD4+CD25 Tcells In the thymus of patientswith aubinmune myasthenia gravis.Blood，2005，102:73-74.

6 Shere K，Bedlack RS，Simel DL.Does this patient have myasthenia gravis.JAMA，2005，293:1906-1914.