喉鱗狀細(xì)胞癌中MMP-1和TIMP-1表達(dá)的臨床病理學(xué)意義

張笑盈 董稚明 趙瑞力 郭艷麗 鄺鋼

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征之一，是影響預(yù)后的重要因素。惡性腫瘤在穿越自然屏障侵襲周圍組織并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程中，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和基底膜(basement membrane，BM)重構(gòu)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在參與ECM降解的酶系中，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inhabitor of mettalloproteinases，TIMPs)起到了關(guān)鍵作用。MMPs幾乎能降解ECM的所有成分，而TIMPs可以與MMPs結(jié)合進(jìn)而抑制MMPs的降解作用［1］。MMP-1屬于間質(zhì)膠原酶，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著非常重要的作用［2］。TIMP-1可與多種活化的MMPs結(jié)合，使其失活或不能活化，與此同時(shí)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的潛能也隨之相應(yīng)的降低［3］。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)狀細(xì)胞喉鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP-1和TIMP-1表達(dá)的研究還比較少，本研究通過免疫組化方法和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法分析MMP-1和TIMP-1在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的蛋白和mRNA的表達(dá)，探討其與喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2006年3月至2008年2月頭頸外科手術(shù)切除的喉鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本，一部分液氮保存用于RNA的提取;另一部分10%甲醛固定用于免疫組化研究。用于提取RNA的喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本49例，男47例，女2例;其中取其癌旁組織(距癌邊緣1.5～2 cm)15例;用于免疫組化研究的喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本51例，男49例，女2例;其中取其癌旁組織(距癌邊緣1.5～2 cm)22例。

1.2 試劑 RT-PCR試劑盒購自Promega公司;Trizol試劑購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;PCR擴(kuò)增體系采用購自Promega公司的Go Taq Green Master Mix;MMP-1和TIMP-1抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法檢測(cè) MMP-1和 TIMP-1在喉磷癌中的表達(dá):全部標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化后，3%甲醇過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高壓抗原分別修復(fù)2 min(MMP-1)和3 min(TIMP-1)。正常山羊血清封閉45 min，依次滴加一抗﹑二抗及三抗，三氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。抗體為兔多抗，一抗稀釋濃度為1∶100，設(shè)立陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。在10×40顯微鏡下觀察細(xì)胞著色強(qiáng)度，陽性細(xì)胞胞漿為棕黃色，根據(jù)顯色強(qiáng)度分為0～3級(jí)［4］:0級(jí):陰性(－)，細(xì)胞無棕黃色染色;1級(jí):弱陽性(+)，細(xì)胞染色較淡;2級(jí):陽性(++)，細(xì)胞中度染色;3級(jí):強(qiáng)陽性(+++)，細(xì)胞染色較深。

1.3.2 RT-PCR法檢測(cè) MMP-1和 TIMP-1的 mRNA表達(dá):按Trizol試劑說明書提取總RNA，并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的比例加樣，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。MMP-1的上游引物為5’－GAGCAAACACATCTGACCTAC －3’;下游引物為 5’－CAAAATGAGCATCCCCTCC－3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 264 bp，TIMP-1的上游引物為5’－GTTGTTGCTGTGGCTGATAG－3’;下游引物為5’－TGTGGGACCTGTGGAAGTA －3’，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為266 bp，內(nèi)參照均為GAPDH，其上游引物為5’－ACCACAGTCCATGCCA－3’，下游引物為 5’－TCCACCACCCTGTTGCTG－3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為456 bp。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min 后，94℃ 變性45 s，52℃ (MMP-1)/58℃ (TIMP-1)退火45 s，72℃延伸 45 s，共 35 個(gè)循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸 10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，用Gel Pro Analysizer 3.1軟件，對(duì)電泳圖像中的表達(dá)進(jìn)行半定量研究。以MMP-1或TIMP-1條帶的光密度值與GAPDH條帶的光密度值的比值作為參數(shù)，得到相對(duì)含量進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以ˉx±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采Person法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉鱗狀細(xì)胞癌中MMP-1和TIMP-1蛋白在各組中的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 MMP-1蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)陽性率顯著高于癌旁組織(P＜0.05)，TIMP-1蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)陽性率低于癌旁組織(P＜0.05)。見表1。MMP-1蛋白表達(dá)與患者的年齡無關(guān)(P＞0.05)，但它在中低分化組中的表達(dá)顯著低于高分化組(P＜0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P ＜0.05)。TIMP-1蛋白表達(dá)與患者的年齡無關(guān)(P＞0.05)，它在中低分化組中的表達(dá)顯著低于高分化組(P＜0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。MMP-1和TIMP-1在喉鱗狀細(xì)胞癌中的蛋白表達(dá)無相關(guān)性(P＞0.05)。見表2。

表1 MMP-1和TIMP-1在喉鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織中的蛋白表達(dá)情況 例

表2 MMP-1和TIMP-1在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及與臨床病理的關(guān)系 例

2.2 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP-1和TIMP-1 mRNA在各組中的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 MMP-1 mRNA在喉鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，TIMP-1 mRNA在癌組織中的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織(P＜0.05)。見表3。隨分化程度的降低MMP-1 mRNA的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，而TIMP-1 mRNA的表達(dá)則顯著降低(P＜0.05);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移MMP-1 mRNA的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.01)，而TIMP-1 mRNA的表達(dá)則顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.01);MMP-1和TIMP-1 mRNA的表達(dá)與患者的年齡無關(guān)(P＞0.05)且 MMP-1和 TIMP-1 mRNA的表達(dá)無相關(guān)性(P ＞0.05)。見表4。

表3 MMP-1和TIMP-1在喉鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織中的mRNA表達(dá)ˉx±s

3 討論

侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤主要生物學(xué)行為之一，惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移需經(jīng)過黏附、酶解、移動(dòng)3個(gè)過程［4］。喉鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是多步驟、多階段的復(fù)雜過程，涉及腫瘤細(xì)胞穿過細(xì)胞外基質(zhì)屏障、血管基底膜及穿出血管壁進(jìn)入宿主微環(huán)境的過程。其中基底膜和細(xì)胞外降解是其中的必要條件［2］。在酶解過程中，有很多的酶系統(tǒng)參與，其中最重要的是MMPTIMP這兩個(gè)酶系統(tǒng)。MMPs具有很強(qiáng)的細(xì)胞外基質(zhì)降解作用，而TIMPs則是MMPs的抑制劑，正常人體中MMPs與TIMPs存在著一種動(dòng)態(tài)平衡，保證了體內(nèi)生理狀態(tài)下細(xì)胞遷移和細(xì)胞外基質(zhì)重建，一旦調(diào)節(jié)失控，就成為腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等病理過程的原因。目前，MMP-1和TIMP-1與喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生關(guān)系的研究較少。

表4 MMP-1和TIMP-1在喉鱗狀細(xì)胞癌中mRNA的表達(dá)及與臨床病理的關(guān)系ˉx±s

MMPs是自然進(jìn)化中高度保守的一類Zn2+依賴性的蛋白質(zhì)酶家族，廣泛分布于植物、脊椎動(dòng)物、無脊柱動(dòng)物中。1962年Gross和 Lapiere分離出第一個(gè)成員膠原酶(collagenase)［5］，此后一系列MMPs家族成員相繼被發(fā)現(xiàn)，至今已發(fā)現(xiàn)有26種以上的MMPs。MMP-1屬于間質(zhì)膠原酶，其作用底物主要是Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原［2］，能使其的三股螺旋分子解螺旋，之后被明膠酶繼續(xù)降解［6］，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著非常重要的作用。研究證實(shí) MMP-1 在食管鱗狀細(xì)胞癌［7］、宮頸癌［8］、膀胱癌［9］、肺腺癌［10］、胰腺癌、卵巢癌［11］等惡性腫瘤中過表達(dá)，并預(yù)示較差的預(yù)后，Ziober等［12］采用原位雜交技術(shù)證實(shí)MMP-1mRNA在口腔鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)。TIMPs是一組能抑制MMPs活性的多功能因子家族，是多基因家族的編碼蛋白質(zhì)，是體內(nèi)細(xì)胞分泌的一類蛋白酶抑制劑，在腫瘤組織與間質(zhì)細(xì)胞中均可表達(dá)。它通過對(duì)MMPs的抑制，在正常細(xì)胞外基質(zhì)改建和各種病理過程中發(fā)揮重要作用。TIMP-1是分子量為28.5 kDa的糖基化蛋白，定位于Xp11，能被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，廣泛存在于組織和體液中。TIMP-1可與多種活化的MMPs及非活化的MMP9結(jié)合，使他們失活或不能活化［3］。在一些體外實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)，TIMP-1mRNA轉(zhuǎn)染的惡性腫瘤細(xì)胞，其MMPs活性表達(dá)水平降低，與此同時(shí)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的潛能也隨之相應(yīng)的降低［3］。

本研究顯示MMP-1蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性率明顯高于癌旁組織，MMP-1 mRNA在癌組織中的相對(duì)表達(dá)量也明顯高于癌旁組織，說明喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與MMP-1密切相關(guān)，這也符合MMP-1的表達(dá)特點(diǎn)，癌旁組織由于沒有發(fā)生BM和ECM的重建，所以表達(dá)較低。MMP-1既可以有效地降解基底膜，又能降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，因此我們的研究提示MMP-1在喉鱗狀細(xì)胞癌的局部浸潤(rùn)過程中起重要作用。我們的研究還證實(shí)MMP-1的表達(dá)在中低分化患者較高分化患者要高、在淋巴結(jié)陽性患者較淋巴結(jié)陰性患者要高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MMP-1可能與喉鱗狀細(xì)胞癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，與國(guó)內(nèi)張狀等［13］采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)80例口腔鱗癌患者M(jìn)MP-1蛋白表達(dá)研究結(jié)果一致。本研究顯示TIMP-1在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與MMP-1相反，與Wallard等［14］的研究結(jié)果相似，提示在喉鱗狀細(xì)胞癌中，可能由于TIMP-1表達(dá)降低，導(dǎo)致其對(duì)MMPs的抑制作用減弱，從而有利于癌細(xì)胞的擴(kuò)散，促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。

1 Douglas B.Invasion and metastasis.Cancer and Metastasis Rev，1996，15:77.

2 Uchida G，Yoshimura K.Tretinoin reverses upregulation of matrix metalloproteinase in human keloid － derived fibroblasts.Exp Dermatol，2003，12:35-42.

3 Brew K，Dinakarpandian D，Nagase H.Tissue inhibitors of metalloproteinases:evolution，structure and function.Biochim Biophys Acta，2000，1477:267-83.

4 LiottaLA，Steeg PS，Stetler－ Stevenson WG.Cancer metastasis and angiogenesis:an imbalance of positive and negative regulation.Cell，1991，64:327-336.

5 Woessner JF Jr.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling.Faseb J，1991，5:2145-2154.

6 Gueders MM，F(xiàn)oidart JM，Noel A，et al.Matrix metalloproteinases(MMPs)and tissue inhibitors of MMPs in the respiratory tract:potential implications in asthma and other lung diseases.Eur J Pharmacol，2006，533:133-144.

7 Murray GI，Duncan ME，O’Neil P，et al.Matrix metalloproteinase-1 is associated with poor prognosis in oesophageal cancer.Pathology，1998，185:256-261.

8 Hilska M，Roberts PJ，Collan YU，et al.Prognostic significance of matrix metalloproteinases-1，-2，-7 and-13 and tissueinhibitors of metalloproteinases-1，-2，-3 and-4 in colorectal cancer.Int J Cancer，2007，121:714-723.

9 Choi YD，Cho NH，Ahn HS，et al.Matrix metalloproteinase expression in the recurrence of superficial low grade bladder transitional cell carcinoma.J Urol，2007，177:1174-1178.

10 Shyu KG，Hsu FL，Wang MJ，et al.Hypoxia － inducible factor 1alpha regulates lung adenocarcinoma cell invasion.Exp Cell Res，2007，313:1181-1191.

11 Benbow U，Schoenermark MP，Mitchell TI，et al.A novel host/tumor cell interaction activates matrix metalloproteinase 1 and mediates invasion through type 1 collagen.JBiol Chem，1999，274:25371-25378.

12 Ziober BL，Turner MA，Palefsky JM，et al.Type I collagen degradation by invasive oral squamous cell carcinoma.Oral Oncol，2000，36:365-372.

13 張狀，李寧毅，陳萬濤，等.口腔鱗癌中MMP-1 MMP-2、uPA的表達(dá)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2006，22:469-473.

14 Wallard MJ，Pennington CJ，Veerakumarasivam A，et al.Comprehensive profiling and localization of the matrix metalloproteinases in urothelial carcinoma.Br J Cancer，2006，94:569-577.