華蟾素注射液聯合化療對小鼠原位移植H22肝癌的影響

崔智

肝癌是一種病死率極高的惡性腫瘤，目前采用手術切除加化療介入治療，放療等多只是延緩癥狀，完全治愈非常困難［1－3］。自古中醫就對肝癌的病機、癥狀皆有詳盡的論述，現代中藥藥理學研究顯示，很多中藥復方具有抗腫瘤作用，或扶助正氣，有助于機體抗御病邪;或通過調整機體免疫力、阻斷細胞突變、誘導腫瘤細胞凋亡、抗炎排毒治療惡性腫瘤;或直接對腫瘤細胞具有抑制作用;或直接特異性殺傷腫瘤細胞［4］。華蟾素注射液是以蟾皮為主要原料研制的一種水溶性制劑，具有良好的抗腫瘤作用，廣泛用于惡性腫瘤臨床治療，如胃癌、食管癌、膀胱癌、白血病等［5，6］。本研究觀察華蟾素注射液聯合化療對BALB/C小鼠原位移植H22肝癌腫瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動物:BALB/C小鼠40只，均為雄性，體重20～25 g，7～8周齡。南方醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(粵)2006-0015。小鼠移植性肝癌瘤株，由華西醫科大學腫瘤研究所提供。

1．1．2 試藥:華蟾素注射液:安徽金蟾生化股份有限公司，5 ml/支;5-氟尿嘧啶(5-Fu):天津氨基酸公司人民制藥廠，針劑，250 mg/支。滅菌0．9%氯化鈉溶液稀釋至2．5 mg/m l后分裝于EP管并用錫紙避光常溫保存。

1．1．3 儀器:流式細胞儀(EPICS型):美國 Beckmancoulter公司;自動平衡離心機(DT5-6A):北京時代北利離心機有限公司;酶標儀(生物梅里埃中國有限公司);電熱恒溫培養箱，Eppendof管，小鼠腫瘤壞死因子α酶聯免疫分析試劑盒(上海希美生物科技有限公司);LKB-V型切片機。

1．2 方法

1．2．1 分組:將BALB/C小鼠，隨機分為4組，每組10只，即模型組，單純化療組(5-Fu)，華蟾素注射液組，化療(5-Fu)+華蟾素注射液組。

1．2．2 造模及給藥方法［7］:小鼠移植性肝癌瘤株，接種于BALB/C鼠腹腔內傳代，傳代7 d后，無菌抽取乳白色H22肝癌腹水，0．9%氯化鈉溶液洗滌2次，每次離心1 000 r/min，5 min。離心后棄去上清，0．2%臺盼藍染色鏡檢細胞活力 ＞98%，0．9%氯化鈉溶液調整癌細胞數至2．5×107/ml，4℃備用。用鹽酸氯胺酮(42 mg/kg)和速眠新Ⅱ(0．42 ml/kg)混合液肌內注射麻醉小鼠。將小鼠仰臥，固定于手術臺上，常規消毒鋪巾，于上腹正中線劍突下做一約0．8 cm的切口進入腹腔。暴露肝臟，輕壓雙側肋弓以擠出左肝葉，濕紗布墊于肝葉下方進行保護，然后用1 ml注射器針頭沿肝葉長軸方向與肝臟成30°斜插入肝實質約0．5 cm，緩慢注入H22肝癌腹水0．03ml(細胞數為7．5×105)。在緩慢拔出針頭的同時，迅速在針眼處壓一直徑約0．5 cm大小的明膠海綿，并在其上用棉簽輕壓1 min止血，然后在針眼周圍用乙醇棉球輕搽以殺死殘留癌細胞。小心將肝臟輕柔回納腹腔，逐層縫合切口，手術完畢。術中平穩進針，避免刺破肝臟，防止癌性腹水漏入腹腔。術后自由進水、進食。術后48 h小鼠仍存活，且無癌性腹水出現則視為造模成功。造模48 h后，按照以下方法給藥:模型組:0．2 ml 0．9%氯化鈉溶液，腹腔注射，1次/d，連續7 d;單純化療組(5-Fu):30 mg/kg，腹腔注射，隔日1次，連續5次;華蟾素注射液組:華蟾素注射液5 m l/kg，腹腔注射，1次/d，連續10 d;化療(5-Fu)+華蟾素注射液組:5-Fu 30 mg/kg，腹腔注射，隔日1次，連續5次;華蟾素注射液5 ml/kg，腹腔注射，1次/d，連續10 d。

1．2．3 觀察指標:①抑瘤率［8］及胸腺指數于給藥結束后第3天將小鼠稱重，摘除眼球法取血處死小鼠，完整剝離腫瘤組織和胸腺組織，剔除周圍結締組織和脂肪，用濾紙吸干臟器表面水分，電子天平稱重，計算抑瘤率和胸腺指數。抑瘤率=(1－給藥組腫瘤質量/模型組腫瘤質量)×100%;胸腺指數=［胸腺質量(mg)/小鼠質量(g)］×10。②血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度酶聯免疫分析法(ELISA)檢測血清中TNF-α濃度:小鼠摘取眼球取血，于4℃保存過夜后，于1 000 r/min離心20 min，取上清液。將洗滌液用三蒸水按1∶20稀釋;于臨用前將標準品用樣品稀釋液稀釋至1 ml，蓋好靜置10 min以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度2 000 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別 稀 釋 2 000 pg/ml，1 000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62．5 pg/ml，31．2 pg/ml，樣品稀釋液(0 pg/ml)直接作為空白孔。進行加樣:分別設空白孔、標準孔(7孔)、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl;輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120 min;棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液100 μl，37℃，60 min。溫育60 min后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，350 μl/孔，甩干;每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液 100μl，37℃，60 min;溫育60 min后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，350μl/孔，甩干;依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色;依序每孔加終止溶液50μl，終止反應;用酶聯儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。在加終止液后15 min以內進行檢測。③細胞周期分析和細胞凋亡檢測［9］取4組新鮮胸腺組織剪碎，用機械網搓法制備單細胞懸液，離心(800 r/min，5 min)洗滌3次后，調整細胞濃度為1×106個/m l，用4℃的70%乙醇固定30 min。用含Rnase及碘化丙啶染色30 min，用流式細胞儀進行DNA測量，檢測速度為每秒鐘1 000個細胞，測量數據輸入hp-300consort 30計算機，使用Muhicycle軟件分析細胞周期。以二倍體峰前出現亞二倍體峰表示凋亡百分率;以增殖指數(PI)=(S期細胞數+G2/M期細胞數)/(G1+S+G2/M細胞數)表示細胞增殖活性。

1．3 統計學分析應用SPSS 13．0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，不同組進行單因素方差分析，各組間采用SNK-q檢驗進行兩兩比較，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 抑瘤率和胸腺指數 各治療組小鼠平均腫瘤組織重量均較模型組顯著降低(P＜0．01)，見表1;華蟾素注射液組和化療+華蟾素注射液組較模型組胸腺平均重量和胸腺指數明顯增高(P＜0．01)，單純化療組較模型組胸腺平均重量和胸腺指數明顯減低(P ＜0．01)。見表2。

表1 4組小鼠腫瘤重量及抑瘤比較n=10，±s

表1 4組小鼠腫瘤重量及抑瘤比較n=10，±s

注:與模型組比較，*P ＜0．01

組別 腫瘤重量(g) 抑瘤率(%)2．91 ±0．19單純化療組 1．52 ±0．12* 47．82華蟾素注射液組 1．70 ±0．10* 41．53化療 +華蟾素注射液組 1．33 ±0．14*模型組54．28

表2 4組小鼠胸腺重量及胸腺指數比較n=10，±s

表2 4組小鼠胸腺重量及胸腺指數比較n=10，±s

注:與模型組比較，*P ＜0．01

胸腺指數模型組組別 胸腺重量(g)52±6 19±7單純化療組 24±10* 8±3*華蟾素注射液組 82±12* 36±13*化療+華蟾素注射液組 72±10* 28±12*

2．2 血清TNF-α濃度 與模型組比較，各藥物治療組血清TNF-α濃度明顯降低(P＜0．05);各藥物治療組間差異無統計學意義(P ＞0．05)。見表3。

2．3 腫瘤細胞周期及細胞凋亡情況 與模型組比較，各藥物治療組腫瘤細胞凋亡率及PI均明顯增高(P＜0．05);化療 +華蟾素注射液組較單純化療組細胞凋亡率及PI均明顯增高(P＜0．05);單純化療組和華蟾素注射液組間差異無統計學意義(P ＞0．05)。見表4。

表3 4組小鼠血清血清TNF-α濃度比較n=10，fmol/m l，±s

表3 4組小鼠血清血清TNF-α濃度比較n=10，fmol/m l，±s

注:與模型組比較，*P ＜0．05

濃度模型組組別 血清TNF-α 16．4 ±3．0單純化療組 12．0 ±2．6*華蟾素注射液組 12．2 ±3．5*化療+華蟾素注射液組 12．2±2．7*

表4 4組小鼠腫瘤細胞凋亡率和PI情況比較n=10，±s

表4 4組小鼠腫瘤細胞凋亡率和PI情況比較n=10，±s

注:與模型組比較，*P ＜0．05;與單純化療組比較，#P ＜0．05

PI模型組組別 凋亡率(%)8．7 ±0．6 12．2 ±1．9單純化療組 24．0 ±1* 28．1 ±0．3*華蟾素注射液組 23．8 ±2．0* 28．0 ±0．7*化療 +華蟾素注射液組 33．3 ±1．0*# 47．0 ±1．0*#

2．4 腫瘤細胞的周期比例 單純化療組對腫瘤細胞S期有阻滯作用;華蟾素注射液阻滯腫瘤細胞于S期;化療+華蟾素注射液組同時作用于細胞周期的S期及G2/M期。見表5。

表5 4組小鼠腫瘤細胞的周期比例n=10，±s

表5 4組小鼠腫瘤細胞的周期比例n=10，±s

注:與模型組比較，*P ＜0．05

組別 G0+G1期(%) S期(%) G2/M期59．4 ±3．7 25．4 ±1．1 24．2 ± 3．8單純化療組 58．9 ±9．4 16．2 ±0．8 25．0 ±4．3華蟾素注射液組 60．4 ±8．8 26．8 ±3．3 12．8 ±2．8*化療 +華蟾素注射液組 76．7±1．9 12．3±3．5* 10．9±3．4模型組*

3 討論

原發性肝癌(HG)是最常見的惡性腫瘤之一，全球2002年肝癌的發病人數626 000人，死亡人數598 000人［10］。目前在我國已屬癌癥死因的第2位，農村地區則為第1位。肝癌對化療不敏感，尤其對于晚期肝癌患者，至今沒有可靠的證據證明全身化療可以提高晚期肝癌的總生存期(overall survival，OS)。

中醫治療肝癌歷史悠久，從《內經》到《諸病源候論》、《外臺秘要》等，認為肝癌是以臟腑氣血虧虛為本，氣、血、濕、熱、瘀、毒互結為標，主病在肝，逐漸徵積而成。臨床上肝癌病情復雜，本虛標實明顯，臨床施治時，既要注意其本虛，常用健脾益氣，養血柔肝，滋補陰液等法以補虛，更要顧及邪實，以活血化瘀，消積理氣，利水消腫等法以祛邪，達到攻補兼施，祛邪不傷正，扶正以達邪的功效。

經過各種治療手段的摸索，很多研究表明聯合治療優于單一治療，而且近年來多項研究發現很多中藥成分具有很強的抗癌作用。蟾蜍(蟾酥)便是中醫較早用于治療癌癥的藥物。李時珍在《本草綱目》中指出其主治“疔瘡惡腫，一切瘡毒”等，唐人段成式也在其《酉陽雜俎》中提到“蟾蜍矢能已毒瘡”。近代科學家從中分離出以含氨酸代替精氨酸的一系列蟾蜍毒素化合物，發現其藥物作用包括對抑制Na+-K+-ATP酶，強心作用，局部麻醉作用，抗腫瘤作用。臨床多用于治療癰疽、腫瘤、疳積、瘰疬等癥。機制認為與下列途徑有關:(1)抑制腫瘤細胞的糖酵解和呼吸過程。(2)通過抑制Na+-K+-ATP酶的作用，使細胞內K+濃度下降，DNA合成被抑制，進而影響細胞的增殖。(3)提高細胞內CAMP濃度，促進非組蛋白型蛋白質的磷酸化，啟動遺傳信息的轉錄和促進細胞向正常分化。(4)提高機體免疫能力，促進巨噬細胞吞噬能力。(5)通過機體必須微量元素( 鋅、硒、銅、錳、鉻)而發揮抗癌作用［11，12］。

蟾蜍的多種制劑也被用于臨床抗癌治療中，如江蘇省啟東肝癌研究所應用復方蟾龍片(蟾蜍、守宮)治療肝癌，在資料較完整的120例中，有效率大50%以上。其中生存期超過半年的有30例，超過1年以上的12例，超過2年以上的3例。啟東肝癌研究所對存活1年以上的85例原發性肝癌進行了分析，有2例應用了大劑量蟾蜍的各類制劑。這2例臨床癥狀消失，AFG檢查轉陰，肝臟縮小，存活3年以上，其中1例還能參加輕微勞動［10］。

本研究提示，華蟾素注射液組和單純化療組均可以明顯抑制腫瘤生長，化療+華蟾素注射液組使抑瘤作用增強。華蟾素注射液組可以使小鼠胸腺重量及胸腺指數增加，考慮與其提高機體免疫力相關。TNF-α具有抗病毒，抗腫瘤及免疫調節等生物學效應，在實體瘤患者體內TNF-α會異常升高，嚴重破壞細胞因子間正向的協調作用，使細胞因子網絡功能紊亂，造成血管滲漏，脂肪降解等病理損傷。華蟾素注射液可以顯著降低肝癌小鼠TNF-α水平，略高于單純化療組，考慮華蟾素注射液可以抑制肝癌小鼠TNF-α水平異常升高，并使其維持在一定水平來發揮其抗腫瘤，免疫調節等作用。

在細胞增殖周期中，在G期和S期之間以及G2期和M期之間，存在著影響細胞周期進行的控制點，藥物可能通過調控這些控制點來影響細胞增殖。研究中通過對細胞周期各時相分布的觀察發現，同模型組相比，單純化療組的腫瘤細胞G2/M期細胞比例增加，華蟾素組的腫瘤細胞S期細胞比例增高，化療+華蟾素組的腫瘤細胞G2/M期、S期細胞比例均高于模型組，也就是抑瘤作用加強。因此，5-Fu聯合華蟾素可以增加對小鼠原位移植H22肝癌的抑瘤作用，并能減輕用5-Fu進行化療時產生的毒性反應。

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10 王瑞敏，王美春，杜麗輝，等．原發性肝癌患者介入治療中應用臨床路徑的效果評價．河北醫藥，2009，31:3161-3162．

11 陳雨鳳，張少華．活血化瘀藥抗腫瘤及腫瘤轉移的作用機理探討．陜西中醫學院學報，2006，29:2．

12 于春艷，李薇，劉玉和，等．白花蛇舌草體外對人肝癌多藥耐藥細胞Bel－7402抗腫瘤活性的研究．北華大學學報(自然科學版)，2004，5:221．