依達拉奉對谷氨酸誘導神經元釋放一氧化氮的影響

譚少華,林耀波,李麗娟

(番禺區(qū)中心醫(yī)院神經內科,廣東 廣州 511400)

谷氨酸(Glutamate,Glu)是神經系統(tǒng)內的興奮性氨基酸,作為神經遞質之一參與體內多種病理生理過程,在腦部缺血缺氧過程中,過多的谷氨酸產生的興奮毒性作用可能引起神經元的凋死亡。一氧化氮(Nitric oxide,NO)作為一種血管舒張因子,不僅對心血管功能有調節(jié)作用,還起著神經遞質的作用[1],有報道發(fā)現(xiàn) NO參與了谷氨酸介導興奮毒性作用[2]。依達拉奉作為一種自由基清除劑,對缺血缺氧狀態(tài)下的神經元的保護作用已得到眾多的研究證實。本研究旨在探討依達拉奉對谷氨酸毒性作用下誘導的神經元釋放 NO的影響,進一步闡明依達拉奉保護神經元的作用機制。

1 材料與方法

1.1 原代神經元的培養(yǎng) 根據(jù)文獻方法并作出改良[3],將出生 24 h內的 SD大鼠分離腦組織后,以一次性注射器(5 ml)針頭搗爛腦組織,注射器反復抽吸 3次,加入 0.125%胰酶(含 0.2‰EDTA)3 ml,置入 37℃水浴箱持續(xù)震蕩消化 3-5 min。細胞計數(shù)后調整細胞數(shù)目為 106/ml,接種于已用多聚賴氨酸鋪板的 6孔培養(yǎng)板上,24 h后換液,并加入阿糖胞苷 -C(終濃度為 10μM)抑制其他細胞生長。24 h后再次換液,終止阿糖胞苷 -C的作用。以后每 2-3 d換上述培養(yǎng)液 1次,培養(yǎng) 7 d后用于實驗。

1.2 神經元純度鑒定 原代神經元培養(yǎng) 7 d后,神經元特異烯醇化酶 (NSE)染色確定分離培養(yǎng)神經元純度:PBS沖洗后加入一抗(兔抗大鼠 NSE:1∶200),4℃冰箱過夜,次日室溫下放置 30 min,加入二抗(山羊抗兔 IgG,1∶200),觀察 NSE陽性細胞率。

1.3 實驗分組 原代神經元培養(yǎng) 7 d后,實驗分為三組,空白對照組、Glu(50μM)組以及 Glu(50 μM)+Eda(100μM)組,分別在加入上述藥物處理前、6 h及 24 h后提取三組培養(yǎng)基作 NO濃度檢測。

1.4 NO的檢測 收集各組培養(yǎng)基后,采用硝酸還原酶法檢測。嚴格按照 NO試劑盒中的檢測步驟,在半自動生化分析儀(ZS/1S,北京中山生物公司)上檢測。

1.5 統(tǒng)計學分析 用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料采用(x±s)表示;數(shù)據(jù)處理采用單因素方差分析,雙尾 t檢驗,以 P值 0.01或者 0.05作為統(tǒng)計學差異界限。

2 結 果

2.1 培養(yǎng)神經元的純度鑒定 NSE是神經元特異性酶,NSE染色是用來鑒定神經元的常用方法。本實驗分離的細胞 NSE染色后可見 95%以上的細胞呈梭形或橢圓形,細胞連接成網狀,細胞邊緣清晰,突起、胞膜及胞漿染色呈棕黃色,細胞核染色呈淡藍紫色,細胞有明顯的突起,提示其神經元純度超過 95%,證實我們培養(yǎng)方法的可靠性。

2.2 谷氨酸對神經元釋放 NO的影響 如表 1及圖 1所示,加藥前三組培養(yǎng)基的 NO濃度基本一致(P＞0.05),加入谷氨酸 6 h及 24 h后,培養(yǎng)基中的 NO濃度明顯升高(P＜0.01),提示谷氨酸能誘導體外培養(yǎng)神經元釋放 NO。

圖1 各組不同時間 NO濃度的變化注:6 h三組間方差分析:F=21.739,P=0.000,與對照組比較,aP=0.000,bP=0.033,Glu組與 Glu+Eda組比較,c P=0.002;24 h三組間方差分析:F=38.366,P=0.000,與對照組比較,d P=0.000,eP=0.027,Glu組與 Glu+Eda組比較,f P=0.000。

表1 加藥前后各組培養(yǎng)液中 NO的濃度(x±s,n=10)

如表 1所見,各組培養(yǎng)基中 NO的濃度均隨時間推移有所上升,為進一步闡明 Glu誘導神經元釋放 NO有無時間依賴性,分別將各組在三個不同時間點檢測的 NO濃度做自身對比(配對 T-test)。

2.3 各組自身加藥前后對照配對 T-test結果

如表 2所見,對照組在加藥 6 h、24 h NO濃度僅輕微上升,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),而Glu組、Glu+Eda組在加藥 6 h、24 h后兩個時間點均較加藥前有明顯的上升(P＜0.01);Glu組、Glu+Eda組加藥后 6 h與 24 h相比,NO濃度雖然都有輕微升高,但差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),提示谷氨酸誘導神經元釋放 NO無明顯時間依賴性,在 Glu作用6 h后,NO的釋放并無隨時間的延長有明顯進一步加強。

表2 各組自身加藥前后對照配對 T-test結果(n=10)

2.4 依達拉奉與谷氨酸誘導神經元釋放 NO的關系 如表 1及圖 1所示,Glu組、Glu+Eda組加藥后 6 h后,NO濃度較對照組均顯著升高(P＜0.01),為對比加入依達拉奉后谷氨酸誘導 NO釋放有無影響,經單因素方差分析,Glu組 NO濃度較 Glu+Eda組升高更明顯(P＜0.01),提示依達拉奉能減少 Glu誘導神經元釋放 NO。加藥后 24 h三組橫向比較的結果與加藥后 6 h的結果亦一致。

3 討 論

3.1 谷氨酸與 NO在神經毒性作用中的相互關系 腦缺血預處理能引起一定程度的誘導型一氧化氮合酶(Indusible nitric oxide synthase,iNOS)表達增加[4],而谷氨酸受體阻斷劑能阻斷腦缺血預處理所引起的 iNOS表達增加,間接提示谷氨酸能誘導NO釋放增加。谷氨酸注入大鼠側腦室內可引起大腦皮質及海馬內一氧化氮合酶(NOS)陽性細胞增多[5],但缺乏直接證據(jù)證實谷氨酸能引起神經元釋放 NO增加。本研究發(fā)現(xiàn),加入 Glu 6 h及 24 h后,培養(yǎng)基中的 NO濃度明顯升高(P＜0.01),提示 Glu能誘導體外培養(yǎng)神經元釋放 NO。谷氨酸、NO作為神經遞質參與體內眾多的病理生理過程。眾多研究表明,缺血缺氧時內源性的谷氨酸誘導的神經毒性作用對誘導神經細胞的凋亡發(fā)揮著重要作用。然而,NO在中樞神經系統(tǒng)中發(fā)揮著雙刃劍的作用,一般認為病理生理過程中,早期釋放的 NO有保護作用,但后期過多的 NO則有神經毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮合酶抑制劑 AMDA(非對稱性二甲基精氨酸)能顯著地減弱谷氨酸對 PC12細胞的興奮毒性作用,其作用機制可能與抑制 NOS活性,減少 NO生成有關[6]。結合本研究提示,谷氨酸損傷神經系統(tǒng)的作用途徑之一可能為通過引起神經元釋放 NO增加。

3.2 依達拉奉與 NO的關系 在非神經系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn),依達拉奉能抑制經細胞因子刺激的肝細胞 iNOS基因的表達[7],同時能延遲大鼠睪丸缺血再灌注后 NO釋放的峰值時間[8]。在神經系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn),NO能引起細胞凋亡,但依達拉奉能減弱 NO供體硝普鈉引起的星形膠質細胞凋亡[9]。Noor等[10]在新生Wistar大鼠缺血缺氧模型的研究中發(fā)現(xiàn),依達拉奉可短暫地降低腦脊液內 NO的含量。上述研究提示在病理狀態(tài)下,依達拉奉可降低NO的釋放。

本研究發(fā)現(xiàn),雖然 Glu組及 Glu+Eda組加藥后6 h后 NO較對照組均有升高(P＜0.01),Glu組一氧化氮濃度較 Glu+Eda組升高更明顯(P＜0.01),提示依達拉奉能減少 Glu誘導神經元釋放 NO。腦缺血再灌注后可產生大量自由基,自由基的生成除造成細胞膜性結構受損外,還能引起谷氨酸等興奮性氨基酸釋放增加,而谷氨酸又可引起 NO釋放增加。NO性質活躍,能迅速分解成自由基,如此惡性循環(huán)造成腦組織損傷。

綜上所述,依達拉奉作為一種自由基清除劑,在腦部缺血缺氧時的保護作用,一方面能減少自由基的堆積,另一方面還可抑制 NO的過量生成。

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