河南漢族缺血性腦血管病患者半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystain C Rs2897119(-177C/T)基因多態性檢測△

路 燕 劉炯波 董 蕾 滕軍放

1)河南新鄉市中心醫院 新鄉 453000 2)河南淇縣人民醫院 淇縣 456750 3)鄭州大學一附屬神經內科 鄭州450052

近年來缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular diseases,ICVD)的病因及發病機制研究已取得很大的進展,半胱氨酸蛋白酶抑制因子C(Cystain C)也受到越來越多研究者的關注。作者通過病例對照研究,采用多聚酶鏈反應-限制性內切酶片段長度多態性技術(PCR-RFLP)方法,探討Cystatin C Rs2897119(-177C/T)基因與ICVD的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 185例缺血性腦血管病(ICVD組)和111例對照組來自2008-10～2009-04鄭州大學第一附屬醫院神經內科住院患者及門診體檢者,均為河南漢族人。ICVD組符合1995年第四屆全國腦血管病學術會議修訂的急性缺血性腦血管病的診斷標準,并經頭顱CT和(或)MRI檢查確診;對照組為無缺血性腦血管病史,無臨床血管事件發生的神經內科其他住院患者及健康體檢者。2組均排除腦出血、蛛網膜下腔出血等出血性腦血管疾病,均無帕金森病、癡呆史,甲狀腺疾病,肝臟及腎臟疾病等及服用葉酸、維生素B12、美多芭等藥物史。ICVD組185例,男122例,女63例,年齡36～86歲。對照組111例,男71例,女40例,年齡32～87歲。各組年齡及性別差異均無統計學意義(χ2=0.120,P＞0.05;t=1.748,P＞0.05)。

1.2 多態性檢測 采用多聚酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法。取EDTA抗凝靜脈血2 m L采用CBM公司基因提取試劑盒提取基因DNA。參照文獻[3]設計引物,上游引物:5'-AGAGCCAGTGACTGAAGAACC-3',下游引物:5'-GATTTACAGCCAAGGAACATG-3',擴增目的片段長度為474 bp。PCR反應體系為30μL:PCR magic m ix 2.0酶15μL,上下游引物各2.0μL,模板DNA 2.0μL,ddH2O補至30μL。PCR擴增條件:95℃預變性5 min;95℃變性45 s,55℃復性45 s,72℃延伸55 s,循環30次;72℃延伸5 min。取3 uL PCR產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳30 m in,EB染色檢驗擴增結果。酶切反應體系為30 μL,包括PCR擴增產物10μL,Sma I 2.0μL,10×Buffer Tango 2.0μL,ddH2O 16μL。酶切產物在30℃水浴箱中溫浴5 h,經25 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,EB染色,紫外凝膠成像儀下觀察帶型并照相。

1.3 統計學處理 所有數據以SPSS統計軟件16.0進行處理。對2組基因型頻率分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。兩組年齡比較進行t檢驗,2組性別比較進行行列表檢驗,2組間基因型及等位基因頻率進行χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組Cystatin C Rs2897119(-177C/T)基因型頻率和基因頻率分布 符合H ardy-W einberg平衡定律(P＞0.05),說明2組樣本有群體代表性。

2.2 Cystatin CRs2897119(-177C/T)基因PCR擴增產物

片段長度為474 bp,經Sma I酶切后,共產生3種基因型:純合型(T/T型)不含酶切位點,只有474 bp;雜合型(C/T型)有474 bp、271 bp和203 bp 3個片段;純合子突變型(C/C型)有271 bp和203 bp 2個片段。增產物見圖1。

2.3 Cystain C Rs2897119(-177C/T)酶切產物 見圖2。

2.4 2組中基因型及等位基因頻率分布特征 見表1。2組中Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)基因型及等位基因頻率分布差異均無統計學意義(P＞0.05)。

圖1 Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)PCR擴增產物電泳圖

圖2 Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)PCR擴增產物分析結果電泳圖

3 討論

缺血性腦血管疾病(ICVD)是嚴重危害人類健康的常見疾病之一,發病率和病死率均居神經系統各類疾病首位,嚴重影響著人們的生活質量及水平,國內學者把缺血性腦血管疾病看作是有多種危險因素相互作用的疾病。近年來有關Cystain C與ICVD關系的研究越來越受到人們的重視,相關研究層出不窮。

Cystain C又稱半胱氨酸蛋白酶抑制因子C,由有核細胞產生,為一種含120個氨基酸殘基多肽鏈的非糖基堿性蛋白,其基因位于20號染色體短臂上,分子量為13.395 kD,它的氨基酸序列在人類大多數組織中能夠穩定的表達,廣泛存在于各種體液中,所有有核細胞均能穩定產生,Cystain C在腦脊液和精液中的濃度最高,尿液中最低。在生理條件下,Cystain C的重要功能是抑制內源性的半胱氨酸蛋白酶的活性,參與細胞內外蛋白質水解的調控,保護細胞免受不適當的內源性或外源性蛋白酶的水解,是目前發現的對組織蛋白酶B抑制作用最強的抑制物。有報道Cystain C有抗病毒和原蟲感染的功能,可以影響中性粒細胞的遷移,可以參與腫瘤的侵襲和轉移,參與炎癥過程及一些神經性疾病[1]。大部分研究認為Cystatin C是一個具有極高的敏感性和較高的特異性的理想腎小球濾過率指標,是反應腎功能受損的重要標志物[2-4]。近年研究發現Cystain C基因突變可導致遺傳性Cystain C淀粉樣血管病,可發生腦動脈血管破裂,而動物模型試驗也證實Cystain C在血中蓄積可以導致腦血管淀粉樣變,考慮Cystatin C可能與腦梗死發病有關[5]。也有報道動脈粥樣斑塊中Cystatin C含量較正常血管減少,而組織蛋白酶S及K卻過度表達,認為Cystatin C的缺失可能是動脈粥樣硬化的發病機制之一[6]。

本研究結果顯示,ICVD組中Cystain C Rs2897119(-177C/T)基因型頻率T/T、C/C、C/T分別為2.2%、81.6%、16.2%,對照組中Cystain C Rs2897119基因型頻率T/T、C/C、C/T分別為3.6%、79.3%、17.1%,2組中T、C等位基因頻率分別為10.3%、89.7%和12.2%、87.8%,兩組中Cystain C Rs2897119(-177C/T)基因型頻率及等位基因頻率差異均無統計學意義,表明Cystain C Rs2897119(-177C/T)多態性可能與ICVD不具有關聯性。本研究結果與國內相關研究結果一致[3],因此Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)基因多態性可能不是ICVD發生的遺傳影響因素。

鑒于所入選的樣本例數較少,收集標本時間較短,地域局限,地區差異性不同,入選病例標準不同,有待于增加入選樣本例數,延長收集病例時間,進行多地區、多中心研究,以進一步明確Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)多態性與ICVD的關聯。

表1 CystainCRs2897119(-177C/T)基因型頻率及等位基因頻率分布 [例(%)]

[1] 何焱,陳敬洲,王惠萍,等.半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystain C基因與中國人卒中的關系[J].中國分子心臟學雜志,2007,7(2):81-84.

[2] 楊繼紅,王雪東,吳華.Cystain C的臨床應用[J].中國中西醫結合腎病雜志,2006,7(8):430-432.

[3] 杭宏達,王可平,林洪麗,等.血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C在臨床中國的應用[J].中華現代臨床醫學雜志,2004,2(3):214-216.

[4] 晏峰,周穎.血半胱氨酸蛋白酶抑制劑C水平對急性腦血管病患者早期腎損害的診斷價值[J].現代中西醫結合雜志,2007,16(31):4 590-4 591.

[5] 劉存杰,王大力,彭延波.血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C與腦梗死的關系[J].中國煤炭工業醫學雜志,2008,11(4),496-497.

[6] 胡欣,徐巖.半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、同型半胱氨酸與冠心病的關系[J].心血管康復醫學雜志,2008,17(5):461-463.