構樹皮中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分

鮑 玲,崔文峰,郁建平,喻凱,王明奎＊

1中國科學院成都生物研究所中國科學院山地生態恢復與生物資源利用重點實驗室,生態恢復與生物多樣性保育四川省重點實驗室,成都 610041;2貴州大學生命科學學院,貴陽 550025;3西南交通大學生物工程學院,成都 610031

構樹皮中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分

鮑 玲1,崔文峰2,郁建平2,喻凱3,王明奎1＊

1中國科學院成都生物研究所中國科學院山地生態恢復與生物資源利用重點實驗室,生態恢復與生物多樣性保育四川省重點實驗室,成都 610041;2貴州大學生命科學學院,貴陽 550025;3西南交通大學生物工程學院,成都 610031

本文報道構樹皮中α-葡萄糖苷酶抑制劑的分離鑒定。構樹皮的乙醇浸膏通過溶劑萃取以及各種柱層析方法分離純化得到 6個化合物,通過波譜學方法鑒定為:broussonetine A(1),broussonetinine A(2),broussonetinine B(3),黑立脂素苷 (liriodendrin)(4),butyrospermyl acetate(5)以及胡蘿卜苷 (6)。所有化合物均首次從構樹中分離得到,其中 1～3具有較強抑制α-葡萄糖苷酶的活性,IC50有分別為 0.530、0.445和 0.460 mg/ mL。

構樹;broussonetine A;broussonetinine A;broussonetinine B;α-葡萄糖苷酶抑制劑

構樹 (B roussonetia papyrifera(L.)Vent)為桑科構屬直立落葉喬木,廣泛分布于全國各地。構屬植物全世界共有四種,中國產三種,其中兩種可作藥用[1]。構樹的果實、樹葉、枝條、莖皮部乳汁和根皮均可入藥,具有補腎清肝,明目利尿、健胃、消炎、涼血止血之功效,用于腰膝酸軟,虛勞骨蒸,頭暈目昏,目生翳膜,水腫脹滿。現代藥理研究表明其具有很好的抗真菌作用。國外學者從小構樹 (B.kazinoki Sieb)中還分離得到很多對α-葡萄糖苷酶有較好抑制作用的多羥基生物堿[2-10],對構樹根皮也進行過研究,從中分離出大量的黃酮和二苯丙烷類化合物,但還沒有關于生物堿類成分的報道[11]。

我們用自己建立的α-葡萄糖苷酶模型[12]在篩選糖苷酶抑制成分的過程中,發現構樹的提取物有較好的抑制活性。因此,我們對構樹皮的成分進行了分離鑒定,并進行了活性測試。從構樹干燥樹皮的乙醇提取物中分離得到 6個化合物,經波譜方法鑒定為:broussonetine A(1)、broussonetinine A(2)、broussonetinine B(3)、黑立脂素苷 (liriodendrin,4)、butyrospermyl acetate(5)和胡蘿卜苷(6)。其中化合物 1～3在體外有較強的抑制α-葡萄糖苷酶的作用。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Avance Bruker 600兆核磁共振波譜儀;LCQ型質譜儀 (美國 Ther mo-Finnigan公司,配置有 ESI離子源和直接進樣注射泵,離子阱質量分析器);D72大孔樹脂 (南開大學樹脂廠);RP-C18材料 (日本和光純藥公司);硅膠 GF254(青島海浪硅膠干燥劑廠);氧化鋁(上海新誠化工有限公司)。

構樹 (B roussonetia papyrifera(L.)Vent)皮樣品于 2006年 5月采自重慶市開縣巫山鄉,由中國科學院成都生物研究所包維楷研究員鑒定。標本保存在成都生物研究所標本室。

1.2 提取分離

干燥構樹皮 16 kg粉碎后,用 95%乙醇冷浸 4次,每次 7 d,合并提取液,減壓濃縮得油狀浸膏 1.3 kg。浸膏冷卻后析出淺黃色固體 1.4 g。其余浸膏用 2000 mL蒸餾水超聲分散,1000 mL氯仿反復萃取4次,水相稀釋到5000 mL后,通過D72大孔樹脂柱(30×5 cm)。用 10 L水,2.5 L乙醇,3 L 5%的氨-乙醇溶液依次洗脫,氨-乙醇洗脫液濃縮,得到固體物 7.7 g。取 3.6 g樣品進行氧化鋁 (100～200目)柱層析(氯仿-甲醇 =15∶1～1∶1梯度洗脫),硅膠(200～300目)柱層析(氯仿-甲醇 =10∶1～1∶1梯度洗脫)和 C18反相柱層析 (10%～40%甲醇水溶液梯度洗脫),得到化合物 1(316 mg)、2(314 mg)、3 (50 mg)和 4(48 mg)。取 0.9 g浸膏中析出的固體,甲醇溶解后拌入 1.2 g硅膠,用 200～300目硅膠經柱層析(石油醚-乙酸乙酯 =20∶1梯度洗脫)得化合物 5(418 mg)。氯仿萃取物減壓濃縮蒸干, 1000 mL甲醇溶解,500 mL石油醚反復萃取 4次,甲醇層 36.2 g拌樣上硅膠柱 (石油醚-乙酸乙酯 =1∶2～1∶4梯度洗脫)分離得到一個固體,用甲醇結晶,得到化合物 6(566 mg)。

2 鑒定

化合物 1 白色粉末,mp.154～156℃,茚三酮顯黃色,ESI-MSm/z508[M+H]+,1H NMR(pyridine-d5,600 MHz)δ:3.78(1H,m,H-2),4.83(1H, t,J=4 Hz,H-3),4.10(1H,m,H-4),3.73(1H,m, H-5),2.00(2H,m,H-1′),1.10-1.59(12H,m,H2′-H7′),1.60(2H,m,H-8′),2.49(2H,t,J=7.6 Hz, H-9′),2.76(2H,t,J=7.6 Hz,H-11′),2.16(2H, quintet,J=7.5 Hz,H-12′),3.96(2H,t,J=6.3 Hz, H-13′),4.30(2H,m,CH2OH),5.08(1H,d,J= 7.8Hz,H-1′′),4.10(1H,m,H-2′′),4.40(1H,m,H-3′′),4.15(1H,m,H-4′′),4.44(1H,m,H-5′′),4.60 (2H,m,H-6′′);13C NMR(pyridine-d5,150 MHz)δ: 61.5(C-2),73.3(C-3),88.9(C-4),59.8(C-5), 35.4(C-1′),29.5(C-2′),29.5(C-3′),29.6(C-4′), 29.7(C-5′),29.9(C-6′),27.4(C-7′),24.0(C-8′), 42.6(C-9′),210.7(C-10′),39.3(C-11′),27.6(C-12′),61.1(C-13′),62.3(CH2OH),105.3(C-1′′), 74.7(C-2′′),78.1(C-3′′),71.2(C-4′′),78.3(C-5′′),62.3(C-6′′),以上數據與文獻[4]報道數據一致,故鑒定為 broussonetine A。

化合物 2 白色粉末,茚三酮顯黃色,ESI-MS m/z346([M+H]+),1H NMR (pyridine-d5,600 MHz)δ:3.83(1H,m,H-2),4.67(1H,br.s,H-3), 4.18(1H,m,H-4),3.64(1H,m,H-5),1.85,1.62 (2H,m,H-1′),1.08～1.58(12H,m,H-2′～H-7′), 1.56(2H,m,H-8′),2.37(2H,t,J=7.5 Hz,H-9′), 2.63(2H,t,J=7.2Hz,H-11′),2.03(2H,quintet,J =7.5 Hz,H-12′),3.92(2H,br.s,H-13′),4.27, 4.22(2H,br,CH2OH)。氫譜數據與文獻[4]報道數據一致,故鑒定為 broussonetinine A。

化合物 3 白色粉末,茚三酮顯黃色,ESI-MS m/z346([M+H]+),1H NMR (pyridine-d5,600 MHz)δ:3.85(1H,m,H-2),4.67(1H,br.s,H-3), 4.20(1H,m,H-4),3.56(1H,m,H-5),1.85,1.62 (2H,m,H-1′),1.08～1.58(12H,m,H-2′～H-6′), 1.56(2H,m,H-7′),2.31(2H,t,J=7.5 Hz,H-8′), 2.43(2H,t,J=7.2 Hz,H-10′),1.84(2H,quintet,J =7.5 Hz,H-11′),1.70(2H,quintet,J=7.5 Hz,H-12′),3.92(2H,br.s,H-13′),4.42(2H,br, CH2OH)。氫譜數據與文獻[4]報道數據一致,故鑒定為 broussonetinine B。

化合物 4 無色針晶 (吡啶),mp.265～266℃。UV(H2O)nm:272,226;I R(KBr)cm-1:3400 (OH),1600,1505;由氫譜、碳譜和質譜推測該化合物為具有對稱結構的糖苷。1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ6.66處出現 1個單峰,為苯環上的 4個芳香氫信號,4.66(2H,d,J=3.8 Hz,H-2,6),4.21 (2H,m,H-4,8),3.83(2H,m,H-4,8),3.14(2H, m,H-1,5),3.76處出現的單峰為苯環上的甲基氫信號,此外,δ4.87處出現的氫信號為葡萄糖上的端基氫,δ3.09～3.62處出現一系列多重峰,歸屬為葡萄糖上的其他氫信號。13C NMR(DMSO-d6,150 MHz)δ:152.6(C-3′),137.1(C-4′),133.8(C-1′),104.3(C-2′),102.7(C-1′′),85.0(C-2,6), 77.1(C-5′′),76.5(C-3′′),74.1(C-2′′),71.3(C-4,8),69.9(C-4′′),60.9(C-6′′),56.4(OCH3), 53.5(C-1,5);ESI-MSm/z:765[M+Na]+,603 [M– glc+Na]+,441[M– glc– glc+Na]+。以上數據與文獻[13]報道一致,故鑒定為黑立脂素苷(liriodendrin)。

化合物 5 白色針晶 (乙酸乙酯),C32H52O2, mp.136～138℃。 IR (KBr)cm-1(max):2932 (OH),1741(C=O),1460,1362;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ:5.25(1H,d,J=2.9 Hz,H-7),5.10 (1H,brt,J=7.0 Hz,H-24),4.52(1H,dd,J= 10.5,4.4 Hz,H-3),0.97(3H,s,H-30),0.93(3H, s,H-29),0.85(3H,d,J=5.6 Hz,H-21),0.85 (3H,s,H-28),0.80(1H,s,H-18),0.77(1H,s,H-19);13C NMR(CDCl3,150 MHz)δ:171.0(C=O), 146.0(C-8),130.9(C-25),125.1(C-24),117.6 (C-7),81.1(C-3),53.2(C-17),51.3(C-14), 50.8(C-5),48.8(C-9),43.5(C-13),37.8(C-4), 36.8(C-1),35.8(C-20),35.2(C-22),34.8(C-10),33.9(C-15),33.8(C-12),28.4(C-16),27.6 (C-28),27.3(C-30),25.7(C-26),25.3(C-23), 24.2 (C-2),23.8 (C-6),22.0 (C-18),21.3 (COCH3),18.6(C-21),18.1(C-11),17.7(C-17),15.9(C-29),13.1(C-19)。以上數據與文獻[14]報道一致,故化合物 5被鑒定為 butyrospermyl acetate。

化合物 6 白色粉末(甲醇),mp.285～287℃。Liebermann-Burchard反應陽性,Molish反應陽性,香草醛-濃硫酸顯紫紅色。與胡蘿卜苷標準品 TLC的Rf值一致。故化合物 6被鑒定為胡蘿卜苷 (daucosterol)。

多羥基生物堿類化合物是一類具有顯著抑制葡萄糖苷酶活性的化合物[15]。對本次研究中所分離得到的化合物 1～6進行了體外α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選,采用經典的大鼠小腸外翻囊蔗糖吸收抑制試驗,發現化合物 1～3在體外有較強的抑制α-葡萄糖苷酶的作用,其 IC50分別為 0.530、0.445和0.460 mg/mL。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可用于治療糖尿病、肥胖癥以及病毒性感冒。構樹生長容易,我國的資源豐富,闡明其具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分將為有效利用這類自然資源提供科學依據。

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2 Shibano M,Kitagawa S,Kusano G,Studies on the constituents ofB roussonetiaspecies.I.Two new pyrrolidine alkaloids,broussonetines C and D,asβ-galactosidase andβ-mannosidase inhibitors fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,1997,45:505-508.

3 Shibano M,Kitagawa S,Nakamura S,et al.Studies on t he constituent s ofB roussonetiaspecies.Ⅱ.Six new pyrrolidine alkaloids,broussonetine A,B,E,F and broussonetinine A and B,as inhibitors of glycosidases fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,1997,45:700-705.

4 Shibano M,Nakamura S,Akazawa N,et al.Studies on the constituents ofBroussonetia species.III.Two new pyrrolidine alkaloids,broussonetines G and H,as inhibitors of glycosidase,fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull, 1998,46:1048-1050.

5 ShibanoM,Nakamura S,KuboriM,et al.Studies on the constituentsofBroussonetia species. IV.Two new pyrrolidinylpiperidine alkaloids,roussonetines I and J,fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,1998,46:1416-1420.

6 ShibanoM,Nakamura S,Motoya N,et al.Studies on the constituents ofBroussonetia species.V.Two new pyrrolidine alkaloids,broussonetines K and L,as inhibitors of glycosidase, fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,1999,47: 472-476.

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8 Shibano M,Tsukamoto D,Fujimoto R,et al.Studies on t he constituent s ofB roussonetiaspecies.V II.Four new pyrrolidine alkaloids,broussonetinesM,O,P,and Q,as inhibitorsof glycosidase,fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,2000,48:1281-1285.

9 Tsukamoto D,Shibano M,Okamoto R,et al.Studies on the constituents ofBroussonetia speciesⅧ,Four new pyrrolidine alkaloids,broussonetines R,S,T,and V and a new pyrroline alkaloid,broussonetine U,fromB roussonetia kazinokiSieb, Chem Phar m Bull,2001,49:492-496.

10 Tsukamoto D,ShibanoM,Kusano G.Studies on the constituents of Broussonetia speciesⅩ.Six new alkaloids from B roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,2001,49: 1487-1491.

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Chem ical Constituents withα-Glycosidase Inhibiting Activity from the Bark ofB roussonetia papyrifera

BAO Ling1,CU IWen-feng2,YU Jian-ping2,YU Kai3,WANGMing-kui1＊1Key Laboratory of M ountain Ecological Restoration and B ioresource U tilization of CAS,Ecological Restoration and B iodiversity Conservation Key Laboratory of Sichuan Province,Chengdu Institute of B iology,Chinese Academ y of Sciences,Chengdu 610041;2The College of B iology in Guizhou University Gui Yang 550025;3School of Life Science&Engineering,Southwest Jiaotong University,Chengdu610013

Theα-glycosidase inhibitorswere isolated and identified from the bark ofB roussonetia papyrifera.By solvent extraction and column chromatography,six compoundswere isolated from ethanolic extracts of this plant for the first time and identified as broussonetine A(1),broussonetinine A(2),broussonetinine B(3),liriodendrin(4),butyrospermyl acetate(5),and daucosterol(6)by spectral evidence.Activity assay indicated that compounds 1-3 had strong glycosidase inhibiting activitieswith IC50value of 0.530,0.445,and 0.460 mg/mL,respectively.

B roussonetia papyrifera;broussonetine A;broussonetinine A;broussonetinine B;glycosidase inhibitor

1001-6880(2010)06-0934-04

2009-02-11 接受日期:2009-04-01

四川省應用基礎研究項目 (2007J13-059)

＊通訊作者 Tel:86-28-85229073;E-mail:wangmk@cib.ac.cn

Q946.91;R284.1

A