肝細胞生長因子促進人胚胎干細胞向神經前體細胞分化＊

胡智興, 耿菊敏, 梁道明

(昆明醫學院1藥理學教研室,2云南省高校生物醫學工程中心,4第二附屬醫院,云南昆明 650500; 3云南省疾病預防控制中心檢驗中心毒理室,云南昆明 650022)

人胚胎干細胞 (human embryonic stem cells, hESCs)在一定條件下可以誘導神經分化。迄今為止,人們已經建立起 hESCs向神經分化的許多方法,證實了多種內外源性神經誘導物質或因子如視黃酸[1]、堿性成纖維細胞因子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)[2]、表皮生長因子 (epidermal growth factor,EGF)[3]、骨形成蛋白 4抑制劑 noggin[4]等,可以誘導 hESCs分化為神經細胞。近年的研究發現,肝細胞生長因子 (hepatocyte growth factor,HGF)可能具有神經誘導作用[5,6],HGF聯合無血清培養基添加劑 G5 supplement可以誘導獼猴胚胎干細胞定向分化成高純度的神經前體細胞 (neural progenitors, NPs),并能整合到大鼠腦部,發生遷移和分化[7]。考慮到不同物種胚胎干細胞基因表達、生長特性,對發育信號的反應等諸多方面均有差異,HGF是否能夠誘導 hESCs的神經分化,產生特定腦區的終末分化神經細胞,需要進一步研究。本研究運用人胚胎干細胞,探討HGF聯合 G5 supplement誘導 hESCs定向分化為NPs的作用,并觀察所誘導的 NPs對于腦區神經信號的反應性,并為最終誘導特定腦區的神經細胞提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 主要材料與試劑

人胚胎干細胞株 BG02購自美國 BresaGen公司;DMEM/F12培養基、knockout血清替代品(knockout serum replacement,KSR)、非必需氨基酸、G5 supplement(成分:胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸、生物素、氫化可的松、bFGF、EGF)、層黏連蛋白 (laminin)、音猥因子 (sonic hedgehog,Shh)購自 Gibco;新生牛血清購自 HyClone;明膠 (gelatin)、青霉素、鏈霉素、絲裂霉素 C、β-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、多聚賴氨酸 (poly-D-lysine,PLL)購自 Sigma;巢蛋白(nestin)鼠抗單克隆抗體、β微管蛋白Ⅲ(βⅢ-tubulin)鼠抗單克隆抗體、O4鼠抗單克隆抗體、神經膠質原纖維酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein, GFAP)兔抗多克隆抗體、musashi-1兔抗多克隆抗體、配對盒基因 6(paired box protein 6,Pax6)-兔抗多克隆抗體、HGF、bFGF購自 Chemicon;Trizol RNA試劑盒購自 Invitrogen。

2 方法

2.1 hESCs的培養 hESCs細胞株BG02培養在絲裂霉素 C(5 mg/L)處理的小鼠成纖維細胞飼養層,培養基成分為:DMEM/F12、1 mmol/L谷氨酰胺、0.1 mmol/Lβ-巰基乙醇、1%非必需氨基酸、20%KSR, 4μg/L bFGF和 1×104U/L青霉素,100 mg/L鏈霉素。hESCs集落生長 5-6 d后,采用機械法對hESCs進行傳代。

2.2 hESCs向 NPs分化[6]將 hESCs集落切割成100-200個細胞大小的團塊,在撤除 bFGF的 hESCs培養基懸浮培養 4 d,誘導擬胚體 (embryonid bodies, EBs)形成。隨機將 EBs分為 4組:(1)正常對照組, EBs培養在神經誘導培養基 (DMEM/F12,1×ITS,2 mmol/L谷氨酰胺);(2)G5組,EBs培養在含 G5 supplement的神經誘導培養基;(3)HGF組,EBs培養在含 10μg/L HGF的神經誘導培養基;(4)HGF +G5組,EBs培養在含 10μg/L HGF和 G5 supplement的神經誘導培養基。各組細胞懸浮培養 7 d,將EBs轉移至 PLL/laminin(20 mg/L)包被的 24孔培養板中繼續培養 7-10 d,待鋪展生長的細胞中出現玫瑰花結樣 NPs時,用 0.3 g/L dispase消化,細胞重新接種于 PLL/laminin包被的 24孔培養板。用 nestin,Pax6和 musashi-1進行染色,統計各組 nestin陽性細胞的比例。

2.3 NPs的擴增和分化 NPs懸浮培養于含有 10 μg/L HGF+G5 supplement的神經誘導培養基上。機械法傳代,用拉細的玻璃針切割成小團塊,每周換液2次。

為了檢測NPs的體外分化能力,將神經誘導培養基撤除 G5 supplement和 HGF,將 NPs消化為單個細胞后,接種于 PLL/laminin包被的培養板上,誘導分化 14 d,分別采用神經元特異性標記βIII-tubulin、星形膠質細胞特異性標記 GFAP、少突膠質細胞特異性標記 O4細胞染色,統計各陽性細胞的比例。

2.4 流式細胞儀檢測不同誘導時間 nestin陽性細胞的比例 在含 HGF和 G5 supplement的神經誘導培養基中分別誘導 0、4、7、10和 12 d的 EBs轉移到PLL/laminin包被的培養板上,貼壁培養 10 d。胰酶消化為單細胞,4%多聚甲醛室溫固定 20 min;PBS沖洗,加 0.4%Triton X-100室溫透膜處理 15 min; PBS沖洗,加入鼠抗單克隆抗體 nestin(1∶200)37℃孵育 1 h;PBS沖洗,加Ⅱ抗室溫孵育 30 min;PBS沖洗,PBS重懸細胞;流式細胞儀 (Becton Dickinson, FACS Vantage S)檢測,每次實驗檢測細胞數大約為1×106個,實驗重復 3次。

2.5 RT-PCR檢測NPs中腦區標記基因的表達在含 100 mg/L Shh的神經誘導培養基,培養 NPs 14 d。RT-PCR檢測神經上皮前體細胞標記基因Pax6、7、前腦前體細胞標記基因 [腦因子 1(brain factor 1,Bf1)、正小齒同源框 1(orthodenticle homeobox 2,Otx2)],后腦、脊索前體細胞標記基因[同源盒基因 (homeobox gene,Hox)b9、HoxC8、HoxC5、Hoxb4、原腸胚形成腦組織同源盒 2(gastrulation brain homeobox,Gbx2)]、中腦 NPs標記[齒狀基因 2(engrailed 2,En2)]、腹側 NPs標記 NK2家族同源框基因 (NK2 homeobox 1,N kx2.1)和 (NK2 homeobox 2, Nkx2.2)的表達。

細胞總 RNA采用 Trizol RNA試劑盒提取。將總RNA(3μg)逆轉錄成單鏈 cDNA,加入引物進行RCR擴增。PCR引物的序列以及相應的 PCR條件、產物的大小見表 1。PCR產物在 1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,溴化乙啶染色后,在紫外下觀察。以看家基因 GAPDH為標準,通過電泳條帶的強弱程度,評價基因表達量的高低。

2.6 免疫細胞染色

細胞用 4%多聚甲醛在室溫下固定 10 min,PBS洗后 0.1%Triton X-100透膜 15 min,加入 10%的羊血清在 37℃封閉 40 min,加入以下Ⅰ抗 4℃過夜:nestin鼠抗單克隆抗體 (1∶200)、βⅢ-tubulin鼠抗單克隆抗體 (1∶200)、O4鼠抗單克隆抗體(1∶100)、GFAP兔抗多克隆抗體 (1∶1 000)、musashi -1兔抗多克隆抗體(1∶200)、Pax6兔抗多克隆抗體(1∶200)。去掉Ⅰ抗后,PBS沖洗 3次,加入Ⅱ抗在37℃下孵育 1 h。以不添加Ⅰ抗而添加Ⅱ抗的細胞作為陰性對照組,檢測Ⅱ抗的非特異性結合情況。染色后的細胞用 Hoechst33342標記細胞核,激光共聚焦顯微鏡(Zeiss,LS M 510 META)進行檢測。

3 統計學處理

表1 PCR引物的序列以及產物的大小Table 1 .Genes PCR pr imer sequences and product lengths

結 果

1 hESCs分化成 NPs細胞及鑒定

機械法將未分化的 hESCs集落 (圖 1A)切割成團塊,懸浮培養于胚胎干細胞培養基中。4 d形成球狀 EBs樣結構(圖 1B),將 EBs團塊進行隨機分組,轉移至 PLL/laminin包被的 24孔培養板上,貼壁生長。第 3-4 d,HGF、G5和 HGF+G5組的 EBs中間開始出現細長的細胞,并排列成玫瑰花樣 NPs(圖1C)。第 8-10 d,在玫瑰花結中間,出現神經管樣NPs(圖 1D);而正常對照組基本上以扁平細胞為主,并未出現玫瑰花樣NPs(圖 1E)。

NPs生長了 10 d后,用 0.3 g/L dispase消化,繼續在 PLL/laminin包被的培養板上進行貼壁培養。免疫細胞染色表明這些細胞表達 nestin(圖 1F),也表達NPs標志musashi-1(圖 1G)和 Pax6(圖 1H)。NPs在去掉 HGF和 G5后,接種在包被有 0.1%明膠的 24孔培養板上,細胞形成單層細胞,連續培養 14 d,分化的細胞出現βIII-tubulin+神經元 (圖 1 I),表達O4的少突細胞(圖 1J)以及 GFAP+的星型膠質細胞(圖 1K)。提示所獲得的 NPs具有分化為 3個譜系的神經細胞的能力。

隨著培養時間的增長,NPs的貼壁能力逐步降低,逐步形成神經球(圖 1L),在含 HGF+G5的神經培養基保持增殖能力。在體外培養了 3個月的神經球采用 nestin染色,結果表明,神經球仍然表達 nestin(圖 1M),說明 HGF+G5能夠長期地支持NPs的生長。

Figure 1.HGF induces human embryonic stem cells(hESCs)to differentiate into neural progenitors(NPs). A:phase contrast microscopic image of human embryonic stem cell line BG02 propagated on mouse embryonic fibroblast cells;B:four-day-old embryoid bodies(EBs)derived from hESCs;C:neural rosette-like structures(arrows)formed in the center of the differentiating cells 10 d after G5 and/or HGF treatment(10 mg/L)treatment;D:neural tube-like structures(arrow)formed on 14 d after G5 and/or HGF(10mg/L)treatment;E:differentiated cells in neural induction medium without G5 and HGF;F:immunofluorescence staining of nestin protein(a NP marker)on NP clump attached on culture plate for 3 d;G:immunofluorescence staining ofMusashi(a neuroepithelium/NP marker)on NPs;H1-H3: immunofluorescence stainingof nestin and Pax6(another neuroepithelium/NPmarker)in neuralprogenitors differentiated from hESCs;I-K:immunofluorescence analysis of three neural lineages differentiated from NPs.NPs differentiated from hESCs were cultured on 0.1%glutin-coated plateswithout growth factors for 7 d to determine the multipotency ofNPs generated. The differentiated cellswere stained for oligodendrocyte markerO4(I),neuron markerβIII-tubulin(TuJ,J),and astrocyte maker GFAP(K);L:NPs cultured in medium supplied with G5 and 10mg/L HGF for 3 mouths could proliferate as neurospheres;M:immunofluorescence staining of nestin on the neurosphere.Blue:Hoechst33342 labeled nuclei.Scale bar:50μm.圖 1 HGF誘導人胚胎干細胞分化成神經前體細胞

2 HGF促進 hESCs分化成 NPs細胞

流式細胞儀定量檢測各組 nestin+細胞占整個分化細胞的比例。如圖 2所示,與正常對照組相比, HGF組和 G5組的 nestin+NPs明顯增多 (P＜0.05), HGF+G5組NPs的 nestin+比例(87.3%±3.9%)顯著高于其它組(P＜0.05)。

Figure 2.The proportion of nestin positive cells differentiated from hESCs in various treatment groups detected by fluorescent activated cell sorter(FACS).A:FACS results of nestin+cells in NPs of various groups;B:the percentages of the nestin+cells in NPs of various groups.±s.n=6.＊P＜0.05vscontrol group;#P＜0.05vsHGF group or G5 group.圖 2 流式細胞儀檢測不同處理組人胚胎干細胞分化的 nestin+細胞比例

3 不同日齡 EB的分化特征

將分別懸浮培養 0、4、7、10和 12 d的 EBs轉移到 PLL/laminin包被的培養板上,貼壁培養 10 d,培養基為含10 mg/L HGF+G5的神經誘導培養基。流式細胞儀檢測 nestin陽性細胞的比例,結果見圖 3,表明隨著 EBs日齡的增加,nestin陽性細胞的比例增加,7 d時達到最大,進入平臺期。

Figure 3.The proportion of nestin positive cells in differentiated cells from embryoid bodies(EBs)in different culture days.EBs cultured in different dayswere further attached on poly-D-lysine/laminin-coated plates for 10 d.The percentages of the nestin+cellswere determined by FACS.±s.n=4.圖 3 不同日齡擬胚體分化的 nest in陽性細胞比例

4 NPs的腦區標記及對神經信號分子 Shh的反應性

用 RT-PCR分析NPs腦區標記的表達,結果如圖 4,HGF(10 mg/L)+G5誘導的NPs表達神經上皮前體細胞標記 (Pax6、Pax7)、前腦前體細胞標記(O tx2、B f1)、中腦前體細胞標記 (En2),而弱表達后腦、脊索前體細胞標記 (Gbx2,Hoxb4),不表達后腦、脊索前體細胞標記 (HoxC8、HoxC5、Hoxb9),也不表達腹側 NPs標記 (Nkk2.1和 Nkk2.2)。這提示所獲得的NPs具有多個腦區前體細胞的特征,而沒有腹側NPs的特征。而在含有 Shh的神經誘導培養基中培養 14 d后,腹側 NPs標志N kk2.1和 Nkk2.2表達增強,前腦標志 O tx2、B f1表達減弱,后腦標志 Gbx2、Hoxb4表達增強。表明NPs在 Shh作用下,初步具有后腦、腹側NPs的特征。

討 論

HGF是一種多效性生長因子,具有促進細胞增殖、遷移、形態發生等作用。研究表明 HGF及其受體在胚胎及成體神經系統中表達[8],HGF能夠促進神經干細胞的自我更新[9],以及神經元存活、再生和功能修復[10]。Schuldiner等[5]的研究表明 HGF能誘導 hESCs分化成神經外胚層細胞,而 HGF聯合 G5 supplement可以誘導獼猴胚胎干細胞定向分化成高純度的NPs[7]。在本實驗中,我們應用 HGF和 G5 supplement有效地誘導hESCs分化成高純度的NPs,并保持NPs的長期增殖培養。NPs可進一步分化成神經元、少突和星型膠質細胞。

Figure 4.Comparison of brain region marker gene expression levels of neural progenitors treated with Shh,a ventralizingmolecule for 14 d.A:brain region marker genes includingPax6,Pax7,Bf1,O tx2,Hoxb9,HoxC8,HoxC5,Hoxb4,Gbx2,En2, Nkx2.1andNkx2.2were analyzed byRT-PCR.Lane 1:neuralprogenitors cultured inmedium without Shh;Lane 2:neural progenitors cultured inmedium with Shh.B:the relative levelof brain regionmarker genes in neuralprogenitors cultured in medium without Shh(untreated group)and neural progenitors cultured in medium with Shh(treated group).±s.n=4.＊P＜0.05vsuntreated group.圖 4 RT-PCR檢測神經前體細胞腦區標記基因的表達

誘導 EBs形成是 hESCs分化最常用的方法,優點是具有空間三維結構,與胚胎發育進程相仿[11]。本實驗發現 EBs的日齡對NPs的誘導有影響,7d的EBs所誘導 nestin+細胞的比例最大。這可能是由于隨著時間增加,EBs直徑增加,內部細胞由于缺乏養分和因子而死亡。此外,以前將獼猴胚胎干細胞誘導分化為神經細胞時[7],采用了含血清的神經誘導體系,而我們采用無血清誘導神經細胞分化。無血清、成分明確的神經誘導培養體系是研究神經細胞分化機制以及細胞替代治療所必須的,因而本研究所使用的神經誘導體系可為今后的研究提供細胞來源。

本研究中分化得到的細胞表達 NPs特征標記(nestin+、Pax6+、musashi+),與以往的報道相符[12],且細胞表達前腦前體細胞標記 (O tx2、B f1)、中腦前體細胞標記 (En2)、后腦、脊索前體細胞標記(Hoxb4),提示 HGF和 G5 supplement所誘導的 NPs具有多個腦區的特征,而 Yan等[13]用 bFGF誘導的神經上皮細胞只具有前腦前體細胞特征。這是否說明 HGF和 G5 supplement所誘導的 NPs具有更廣泛的腦區特征,還有待于今后的研究。此外,神經系統的發生包含了若干個由信號分子精密控制的連續步驟,其中第一步就是外胚層分化成神經上皮細胞,然后神經上皮細胞在特定的神經信號分子的作用下,分化為特定腦區的前體細胞,繼而分化為終末分化的細胞。我們把腹側化神經信號分子 Shh添加到神經誘導培養基中,結果細胞表達腹側化基因 (N kk2.1和Nkk2.2),前腦標記表達下調,而后腦標記表達上調。提示誘導得到的NPs能對神經信號分子產生反應,有可能產生特定腦區的終末分化神經細胞。將NPs分化成高純度的終末分化細胞是下一步工作重點。

本研究中采用了 G5 supplement,主要活性成分為 EGF和 bFGF。以前的研究表明 EGF和 bFGF在神經系統的發育過程中起著重要的作用,已用于NPs的誘導分化和增殖[14,15]。我們的結果表明 HGF+ G5能夠更加有效誘導 hESCs的神經分化,nestin陽性細胞的比例高于 G5組,說明 HGF和 G5 supplement之間有協同作用。然而這種協同作用到底是如何誘導 hESCs向神經細胞分化,有待于深入的研究。

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