HSP60及 TLR4信號途徑在小鼠心臟移植物中的表達及意義＊

陳家軍, 吳宏妍, 孫宗全, 聶榮華, 吳富常, 張增旺

(1襄樊市中心醫院心胸外科,湖北襄樊 441021;2華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院心外科,湖北武漢 430022)

移植排斥反應是制約心臟移植遠期效果的重要因素,其機制目前尚未完全闡明。近來很多證據顯示 Toll樣受體 4(Toll-like receptor,TLR4)信號途徑在啟動移植排斥反應中起著關鍵性的橋梁作用[1],熱休克蛋白 60(heat shock protein,HSP60)作為內外源性配體與 TLR4等分子結合,可能通過調控單核/巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原呈遞細胞的活化、分化群 80(cluster of differentiation 80,CD80)等第二信號的表達,在移植免疫中發揮重要作用[2,3]。為了解 HSP60及 TLR4信號途徑心臟移植排斥反應中的作用及可能機制,我們對小鼠心臟移植物HSP60、TLR4及其下游分子髓樣分化因子 88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、核因子 -κB (NF-κB)的表達情況進行了研究。

材 料 和 方 法

1 材料

抗小鼠HSP60、MyD88及NF-κB抗體購于Lab vision,抗小鼠 TLR4抗體購于 Abcam,辣根過氧化物酶偶聯羊抗兔 IgG抗體及羊抗小鼠 IgG抗體購于北京中山生物技術有限公司,ECL增強型化學發光顯色試劑盒為 Pierce產品,細胞因子 EL ISA試劑盒購于晶美公司,其它試劑均為進口或國產分析純。

2 動物分組與模型

健康雄性BALB/c小鼠 12只和 C57BL/6小鼠36只,體重 20-25 g,2-3個月齡,由華中科技大學同濟醫學院器官移植研究所提供。隨機分為 2組: (1)對照組(同系移植組):供、受體各 12只,供、受體均為 C57BL/6小鼠;(2)實驗組 (同種異品系移植組):供、受體各 12只,供、受體分別為 BALB/c、C57BL/6小鼠。采用袖套管技術制作小鼠頸部心臟移植模型,自制內徑分別為0.4 mm和0.6 mm的動、靜脈套管,利用套管將受者頸總動脈與供心主動脈吻合,受者頸外靜脈與供心肺動脈吻合,術后每天觸診觀察移植心存活時間。

3 免疫組化檢測心臟移植物 HSP60、TLR4、M yD88及NF-κB表達的變化

移植后第 3 d、第 7 d取小鼠心臟移植物,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋切片。然后脫蠟、水化,3% H2O2室溫封閉 5-10 min,羊血清封閉液室溫封閉 30 min。滴加各種Ⅰ抗,4℃濕盒過夜,PBS清洗后滴加1∶100辣根酶HRP標記山羊抗兔 IgGⅡ抗,室溫孵育30 min,PBS清洗后滴加辣根過氧化物酶,DAB顯微鏡下控制顯色,蘇木素復染。顯微鏡觀察、攝像。

4 W estern blott ing檢測心臟移植物 HSP60、TLR4、M yD88及 NF-κB的表達

移植后第 3 d、第 7 d取小鼠心臟移植物,參照《分子克隆》的實驗方法,包括蛋白提取、電泳、轉印、雜交及顯色,X光片曝光顯影,凝膠成像分析系統攝像分析。

5 病理分析及排斥反應分級

移植后第 3 d、第 7 d取小鼠心臟移植物,做病理切片,蘇木精 -伊紅(HE)染色,光鏡觀察,并對病理組織排斥反應等級評分,分級標準[4]:0級:無排斥反應表現;1級:少量而散在的單核細胞浸潤或輕度的心肌細胞變性;2級:中度的單核細胞浸潤或片狀心肌細胞變性;3級:中、重度單核細胞浸潤與明顯的心肌細胞變性和/或灶狀壞死;4級:重度單核細胞浸潤與大片心肌細胞變性、壞死,間質可有出血。

6 酶聯免疫法(EL ISA)檢測受體小鼠血 TNF-α、I L-12及 IFN-γ的濃度

分別于移植后第 3 d、第 7 d取小鼠血清,按EL ISA試劑盒說明操作,每組設 3復孔,檢測 TNF-α、IFN-γ和 IL-12的含量。

7 統計學處理

采用 SPSS 13.0軟件包分析,數據以均數 ±標準差(±s)表示,采用獨立樣本 t檢驗。

結 果

1 免疫組化檢測心臟移植物 HSP60、TLR4、M yD88及NF-κB的變化

對照組移植術后 3 d、7 d移植心臟局部 HSP60、TLR4、MyD88及NF-κB均呈陰性或弱陽性表達,而實驗組均呈強陽性表達,HSP60、MyD88及NF-κB 7 d時的表達均強于 3 d時,而 TLR4 3 d時的表達強于 7 d時。HSP60的表達主要位于心肌細胞胞漿及浸潤的炎性細胞;TLR4的表達主要分布于心肌細胞,血管內皮細胞及血管周圍、心肌間浸潤的單核細胞;MyD88主要表達于心肌細胞胞漿;NF-κB主要表達于心肌細胞及血管周圍、心肌間浸潤的單核細胞,見圖 1-4。

2 W estern blotting檢測心臟移植物 HSP60、TLR4、M yD88及 NF-κB的表達

對照組移植術后 3 d、7 d移植心臟局部 HSP60、TLR4、MyD88及NF-κB的表達均較低;實驗組移植術后7 d時HSP60、MyD88及NF-κB的表達明顯高于移植術后 3 d,TLR4 3 d時的表達強于 7 d時。與對照組相比,各時點 HSP60、MyD88及NF-κB的表達均增強,差異顯著 (P＜0.05),見圖 5。

3 心臟移植物病理形態分析

對照組移植術后 3 d、7 d均未見明顯移植排斥反應;實驗組移植術后 3 d排斥反應的病理分級為 2 -3級,7 d時為 4級,見圖 6。

Figure 1. Expression of HSP60 in immunohistochemicallystained cardiac allograft from two groups(SP,×200). A:control(isograft)group;B:experimental(allograft)group.圖 1 免疫組化顯示 HSP60在 2組心臟移植物中的表達變化

Figure 2. Expression of TLR4 inimmunohistochemicallystained cardiac allograft from two groups(SP,×200). A:control group;B:experimental group.圖 2 免疫組化顯示 TLR4在 2組心臟移植物中的表達變化

Figure 3. Expression of MyD88 in immunohistochemicallystained cardiac allograft from two groups(SP,×200). A:control group;B:exper imental group.圖 3 免疫組化顯示M yD88在 2組心臟移植物中的表達變化

Figure 4. Expression of NF-κB in immunohistochemicallystained cardiac allograft from two groups(SP,×200). A:control group;B:experimental group.圖4 免疫組化顯示 NF-κB在2組心臟移植物中的表達變化

4 心臟移植后外周血 TNF-α、I L-12及 IFN-γ的變化

對照組移植術后 3 d、7 d外周血 TNF-α、 IL-12及 IFN-γ的濃度未見明顯變化;與對照組相比,實驗組各時點外周血 TNF-α、 IL-12及 IFN-γ的濃度明顯升高,且 7 d較 3 d時的濃度顯著升高,差異顯著(P＜0.01),見圖 7。

Figure 5.Expression of HSP60,TLR4,MyD88 and NF-κB in cardiac transplantation from two groups by Western blotting.±s.n=6.★P＜0.05vscontrol group,▲P＜0.05vsexperimental group at 3d after heart transplantation.圖 5 W estern blott ing檢測 HSP60、TLR4、M yD88及 NF-κB蛋白在 2組心臟移植物不同時點的表達變化

討 論

最近研究認為,Toll樣受體 (TLRs)及其信號途徑是銜接先天性免疫和獲得性免疫的橋梁,在移植免疫中扮演重要角色[5]。TLR4所識別的病原相關分子模式配體包括外源性微生物分子,以及細胞膜破損和應激釋放的內源性物質。心臟移植手術創傷、缺血再灌注及應激損傷均可使細胞釋放抗原性很強的 HSP60,并通過 TLR4以MyD88依賴的途徑活化單核巨噬細胞及血管內皮細胞等多種細胞[6],激活NF-κB,活化相關免疫基因,上調前炎性細胞因子、CD80、CD86等共刺激分子和化學趨化因子表達,促使DC等抗原提呈細胞成熟,誘導產生效應細胞和細胞因子,引起急慢性排斥反應[7]。

本研究顯示,實驗組各時點 HSP60的表達均強于對照組,同時伴有 TLR4、MyD88及NF-κB的表達增高,且實驗組心臟移植物出現明顯排斥反應,說明 HSP60作為內源性抗原物質參與了移植排斥反應。正常條件下,HSP60以穩定狀態存在于細胞質和線粒體基質中,應激時 HSP60迅速從胞質中轉移到線粒體基質以修復線粒體基質中的變性蛋白[8],保護細胞免受應激傷害作用,提高細胞的“應急耐受”能力,而當心臟移植后 HSP60釋放至細胞外時,則作為同種異體抗原激活炎性反應[9]。關于 HSP60參與排斥反應的詳細機制有待進一步研究。

Figure 6.Cardiac transplantswere stainedwith HE formorphological evaluation in two groups at7 d after transplantation(HE staining, ×200).A:control group;B:experimental group.圖 6 HE染色及 2組心臟移植物 7 d時病理組織學變化

Figure 7.Expression of TNF-α,IFN-γand IL-12 in peripheral blood from two groups by EL ISA.A:expression of TNF-αin two groups;B:expression of IFN-γ in two groups;C:expression of IL-12 in two groups. ±s.n=6.＊＊P＜0.01vscontrol group;▲▲P＜0.01vsexperimental group(3 d).圖 7 心臟移植后 2組外周血中 TNF-α、IFN-γ及 I L-12濃度比較

本實驗中,實驗組各時點 TLR4、MyD88及NF-κB的表達均強于對照組,且 7d時MyD88及NF-κB的表達明顯高于移植術后 3d,說明在心臟移植排斥反應中存在 TLR4信號途徑的激活。有證據顯示細胞因子參與了移植排斥反應[10],本實驗結果亦表明,實驗組各時點外周血中 TNF-α、 IL-12及 IFN -γ的濃度明顯升高,實驗組 7d時細胞因子的濃度明顯高于 3d,且與排斥反應的病理分級變化一致,表明上述細胞因子與心臟移植排斥反應的發生發展密切相關。TNF-α、 IL-12及 IFN-γ均為 Th1型細胞因子,其中 IL-12最為重要,主要由抗原提呈細胞,如單核巨噬細胞及DC產生,少部分由B淋巴細胞產生[11]。 IL-12作為一種多功能細胞因子,在移植排斥反應中具有獨特的生物學作用[12,13]:促進 T細胞及自然殺傷(NK)細胞增殖;誘導細胞毒性 T細胞成熟并增強其細胞毒作用;誘導靜止及活化NK細胞及 T細胞產生 IFN-γ;誘導其它細胞產生 TNF-α、IL-2、 IL-3等 Th1型細胞因子產生,促進 Th1細胞發育,同時抑制 Th2細胞發育。

單核/巨噬細胞的激活、內皮細胞的損傷及中性粒細胞的浸潤是移植排斥發生的重要機制,細胞間及細胞與細胞因子間的作用是其發生的基礎。本實驗中,免疫組化提示 HSP60、TLR4、MyD88及 NF-κB多分布于心肌細胞、血管內皮細胞及血管周圍、心肌間浸潤的單核細胞 (圖 1-4),由此我們可以推測,心臟移植后釋放 HSP60及其它多種內源性物質,經抗原提呈細胞提呈給 T細胞,以MyD88依賴的方式激活 T細胞增殖,同時心肌細胞間及血管內的粒單核細胞等細胞表面的 TLR4被激活,促進單核細胞、巨噬細胞及DC釋放 TNF-α、 IL-12及 IFN-γ等炎性介質,導致早期炎癥因子的瀑鏈式反應,促進排斥反應,但其詳細機制有待進一步證實。Western blotting顯示實驗組 7 d時 TLR4的表達弱于 3 d時,與MyD88及NF-κB的變化不一致,可能的原因為,心臟移植后在大量內外源性抗原刺激下,機體啟動了負反饋調節的保護機制,通過內吞作用,將 TLR4配體受體復合物轉移到溶酶體中降解,即受體下行調節,清除有害的炎癥因子,減輕其對機體的損害[14]。

本研究結果表明,心臟移植后釋放的內源性配體 HSP60可能激活 TLR4信號途徑引起排斥反應,提示 HSP60在移植排斥反應中可能具有重要作用,調控其受體后信號途徑可能為抗排斥反應提供新思路。

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