鰱魚骨骼肌輕酶解肌球蛋白基因的cDNA克隆

王玲軍, 陶妍, 黨靜, 王孫勇

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306)

在魚類肌肉蛋白質(zhì)的組成中,肌球蛋白約占肌原纖維蛋白的50%以上,它主要決定了魚肌肉蛋白質(zhì)的加工適性。肌球蛋白分子含有兩個相對分子質(zhì)量約200 000的重鏈亞基和4個相對分子質(zhì)量約20 000的輕鏈亞基,每個重鏈的氨基端形成一個球狀的頭部(S1)和頸狀結(jié)構(gòu)(S2),余下的羧基端形成具α-螺旋結(jié)構(gòu)的被稱之為輕酶解肌球蛋白(light meromyosin,LMM)的尾部;兩對輕鏈分別非共價地結(jié)合在重鏈的頸部[1]。肌球蛋白分子的頭部具有ATPase的活性;而LMM具有使肌球蛋白在生理條件下形成絲狀的能力,它的結(jié)構(gòu)性質(zhì)在很大程度上決定了魚肌肉蛋白質(zhì)的凝膠形成特性[2]。

自從1990年 Gerlach等[3]首次報道了鯉魚(Cy prinus carpio)肌球蛋白重鏈基因的多樣性后,Kikuchi等[4]進(jìn)一步證明了鯉魚肌球蛋白重鏈屬于“多基因家族”。3種與馴化溫度相關(guān)的肌球蛋白重鏈同工型基因從溫度馴化的鯉魚骨骼肌中被分離到,并且這些同工型基因伴隨馴化溫度的表達(dá)模式也被確定[5];近年來,3種草魚(Ctenopharyngodon idellus)肌球蛋白重鏈同工型基因也被分離,它們之間在LMM的一級結(jié)構(gòu)上展現(xiàn)了明顯的差異[6-7]。

綜觀世界淡水漁業(yè)的發(fā)展,低成本、高產(chǎn)量的低值淡水魚占淡水魚總產(chǎn)量的50%以上[8]。鰱魚(Hy pophthalmichthys molitrix)屬我國淡水魚資源中具有代表性的魚種之一,具有低值、高產(chǎn)的特點(diǎn),因此也是加工利用的主要對象。為了探明鰱魚肌肉蛋白質(zhì)的加工適性,對來自不同季節(jié)的鰱魚骨骼肌肌球蛋白Ca2+-A TPase的熱穩(wěn)定性和凝膠形成特性進(jìn)行了測定和比較,發(fā)現(xiàn)春、夏季鰱魚肌球蛋白的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于秋、冬季鰱魚的[9,10],并且它們在凝膠形成模式上也不同[11]。然而,迄今為止,國內(nèi)外關(guān)于鰱魚肌球蛋白分子水平上的研究報道很少。據(jù)此,作者以夏季和冬季鰱魚為研究對象,對編碼其骨骼肌LMM的部分基因進(jìn)行cDNA克隆,以期分離不同的肌球蛋白重鏈同工型基因,并比較不同同工型之間在LMM的一級結(jié)構(gòu)氨基酸組成上的差異,初步探明鰱魚肌球蛋白的功能性質(zhì)發(fā)生季節(jié)性變化的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鰱魚(體質(zhì)量730 g,體長40 cm),取自上海市青浦區(qū)養(yǎng)殖場,于2005年8月和2006年1月購自上海市圖們路農(nóng)貿(mào)市場,分別作為夏季和冬季的實(shí)驗(yàn)材料。鮮活鰱魚運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后,用鈍器擊斃,立即取其背部白色骨骼肌切成1 cm×1 cm×1 cm見方小塊,用液氮快速凍結(jié)后,保存于-80℃冰箱待用。

1.2 總RNA提取和第一股cDNA合成

取-80℃保藏的鰱魚肌肉約0.4 g于50 mL離心管中,立即加入 Trizol試劑(100 mg∶1 mL)(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA),用高速組織搗碎機(jī)處理2～3 min;取1 mL搗碎液于1.5 mL離心管中,28℃下靜置5 min,加入0.2 mL氯仿,來回振蕩15 s,28℃下放置2～3 min;采用高速冷凍離心機(jī)離心15 min(4℃,11 900g);上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中,加入0.5 mL異丙醇,28℃下靜置10 min,離心10 min(條件同上);沉淀加75%酒精1 mL,離心15 min(4 ℃,≤7 500g);棄去上清液,沉淀在鋁箔上自然干燥 30 min后,溶解于10μL DEPC·H2O中,-80 ℃保存。

第一股cDNA的合成使用Super RT Kit(Invitrogen Corp)。2μL總 RNA、5μL AP通用引物(Adapter Primer)、2μL ddH2O混勻,70 ℃保溫10 min,冰浴 1～2 min;依次加入 4μL 5×First strand buffer、4μL dNTP mixture(2.5 mmol/L)、2μL DTT(0.1 mol/L),42 ℃保溫 2 min,再加入1μL Reverse Transcriptase(RNase H-)(200 U/L)保溫70 min;70℃保溫15 min、冰上冷卻后得到第一股cDNA。

1.3 輕酶解肌球蛋白基因的PCR擴(kuò)增

分別以冬季和夏季鰱魚的第一股cDNA為模板,通過3′-RACE法對編碼鰱魚肌球蛋白重鏈羧基端的部分輕酶解肌球蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增,見圖1。正向引物為MYH-12F (5′-CTGCACTCTCAGAACACAAGCCT-3’),該引物根據(jù)鯉魚肌球蛋白重鏈同工型基因的保守序列設(shè)計;反向引物為AUAP通用引物(Abridged Universal Amplification Primer)(5′-GGCCACGCGTCGACTA GTAC-3′)。PCR反應(yīng)體系如下:5μL第一股cDNA、各5 μL 10μmol/L的正向和反向引物、2.5μLEx TaqDNA polymerase(5 U/μL)(Takara,Otsu,Japan)、10μL 10 ×ExTagBuffer、16μL dN TP Mixture,用無菌水將反應(yīng)液調(diào)至100μL。PCR反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性4 min、94℃變性30 s、59℃退火1 min、72℃延伸1 min、最終72℃終延伸5 min,共進(jìn)行30個循環(huán)。

圖1 鰱魚部分輕酶解肌球蛋白基因的PCR擴(kuò)增策略圖Fig.1 Schematic representation of PCR amplification for partial light meromyosin from silver carp

1.4 序列分析

通過PCR擴(kuò)增得到的目的片段經(jīng)DNA純化試劑盒(天根生物科技公司,北京)純化后,與p GMT質(zhì)粒載體(天根生物科技公司,北京)按1∶1在16℃下用 T4DNA連接酶連接過夜,然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 Top10;通過藍(lán)白篩選后,采用 PCR法進(jìn)行插入檢驗(yàn),每個平板挑選8～10個陽性克隆,由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行DNA測序。采用Chromas Version 1.62和BioEdit Version 7.0.5對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 氨基酸的親水性分析和分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建

通過BioEdit Version 7.0.5軟件,根據(jù) Hopp等[12]的方法對所得鰱魚兩種肌球蛋白重鏈同工型基因的氨基酸序列進(jìn)行親水性分析。分子系統(tǒng)樹根據(jù) Saitou等[13]提出的鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建。作者將鰱魚兩種同工型的部分LMM區(qū)域的氨基酸序列與其他鯉科魚類和溫血動物的相應(yīng)序列相比較,用CLUSTAL W進(jìn)行多重比對后,通過 MEGA version 3.1[14]軟件對獲得的結(jié)果進(jìn)行聚類分析,系統(tǒng)樹中各結(jié)點(diǎn)的置信度由自引導(dǎo)值(Bootstrap value)估計,重復(fù)次數(shù)為1 000。用于構(gòu)建分子系統(tǒng)樹的序列除表1中涉及的3種鯉科魚類的各種肌球蛋白重鏈同工型之外,其它的序列來自于:Cad-雞的成熟骨骼肌(U87231)[15]、Rperi-圍產(chǎn)期大鼠的肌肉 (X04267)[16]、Rα-大鼠α心臟肌 (X15938)[17]、Rβ-大 鼠β心臟肌(X15939)[18]、Argo-扇貝A rgopecten irradians橫紋肌(X55714)[19]、Placo-扇貝Placopecten magellanicus橫紋肌 (U59294)[20]、Cgiz-雞的胃組織(X06546)[21]、Cnon-雞的非肌肉組織(M26510)[22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 鰱魚肌球蛋白重鏈同工型基因的分離及部分輕酶解肌球蛋白基因的核苷酸序列比較

以基于冬季和夏季鰱魚的第一股cDNA為模板,均擴(kuò)增得到了大約750 bp的DNA片段;將這兩個片段純化后插入p GM-T質(zhì)粒載體,分別隨機(jī)挑選8～10個陽性克隆用于測序。結(jié)果表明,基于冬季鰱魚的所有克隆均顯示了相同的DNA序列,而基于夏季鰱魚的所有克隆亦顯示了相同的DNA序列。但是,這兩種克隆之間在DNA序列上顯示了明顯的差異,它們之間的核苷酸同源性僅79.5%(表1、圖2)。前人的研究工作已經(jīng)證明了哺乳動物肌球蛋白重鏈同工型基因之間在3′-和5′-區(qū)域會顯示大的序列差異[23];Imai等[5]和 Tao等[6]分別從鯉魚和草魚骨骼肌中分離到的3種肌球蛋白重鏈同工型基因之間在終止密碼子的上游和下游區(qū)域顯示了較低的核苷酸同源性。作者從鰱魚骨骼肌中分離到的兩種cDNA克隆之間在終止密碼子的上游和下游區(qū)域亦顯示了較大的核苷酸序列差異,據(jù)此,可以認(rèn)為這兩種cDNA克隆代表了兩個不同的肌球蛋白重鏈同工型基因,它們分別被命名為低溫型(sc-w)和高溫型(sc-s)。Yuan等[24]曾在蛋白質(zhì)水平上報道了與季節(jié)溫度變化相關(guān)的兩種鰱魚肌球蛋白同工型,他們發(fā)現(xiàn)兩種同工型之間在蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、凝膠形成特性等方面顯示了明顯的差異。將鰱魚兩種cDNA克隆與草魚和鯉魚的相應(yīng)核苷酸序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)鰱魚低溫型(scw)與草魚 10℃型(gc10)之間的同源性高達(dá)96.1%、鰱魚高溫型(sc-s)與草魚中間(gcI)和30℃型(gc30)之間的同源性則較高;另一方面,鰱魚高溫型(sc-s)較其低溫型(sc-w)與鯉魚3種同工型之間顯示了更高的同源性。

表1 鰱魚、草魚和鯉魚輕酶解肌球蛋白cDNA克隆的核苷酸序列及推斷的氨基酸序列的同源性Tab.1 DNA nucleotide and deduced amino acid sequences identities between light meromyosin cDNA clones isolated from silver carp and those of grass carp and common carp

圖2 鰱魚、草魚和鯉魚部分輕酶解肌球蛋白基因的核苷酸序列比較Fig.2 The comparison in the nucleotide sequences of partial light meromyosin genes from silver carp and those of grass carp and common carp

2.2 鰱魚部分輕酶解肌球蛋白的氨基酸組成分析

根據(jù)編碼鰱魚兩種肌球蛋白重鏈同工型的部分輕酶解肌球蛋白的cDNA序列推斷其氨基酸序列,并進(jìn)行比對,同時與草魚和鯉魚的相應(yīng)氨基酸酸序列進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,sc-w與sc-s的氨基酸同源性僅為88.1%,見表1;sc-w與gc10之間顯示了97.2%的最高同源性。而sc-s與gcI和gc30之間顯示較高的同源性,分別為96.8%和94.9%,與cc30顯示94.9%的同源性。根據(jù)Tao等[6]的報道,gcI也是從30℃馴化的草魚骨骼肌中分離到的。另外,sc-w、gc10和ccI的氨基酸序列較其它同工型的氨基酸序列均縮短了一個氨基酸殘基,見圖3。根據(jù)Imai等[5]的報道,ccI不同于gcI,它主要是從10℃馴化的鯉魚骨骼肌中分離到的。結(jié)果似乎表明了來自于相似溫度環(huán)境的淡水魚在肌球蛋白重鏈的結(jié)構(gòu)上更具有相似性。然而,sc-w與鯉魚的cc10之間反而顯示了較之與ccI和cc30之間略低的氨基酸同源性,此結(jié)果亦出現(xiàn)在草魚3種與鯉魚3種全長LMM同工型的氨基酸比對中[7],可能與cc10的基因歧化有關(guān),此推測被以下的分子系統(tǒng)樹進(jìn)一步證明。

由圖3的陰影部分可以發(fā)現(xiàn),sc-w和gc10在His-21、Ser-24、Thr-29、Leu-49、Ser-62、Asn-87、Asp-140、Ala-147、Ser-167、Gly-176、Tyr-177、Lys-180、Leu-181、Glu-192、Glu-217 的氨基酸殘基位點(diǎn)上顯示了與其它同工型不同的特有變異,并且其中His-21、Ser-24、Leu-49、Ser-62、Asn-87、Asp-140、Ser-167、Gly-176、Tyr-177、Lys-180、Leu-181 顯示了高度的保守。根據(jù) Hopp等的方法[12],對兩種鰱魚同工型的部分輕酶解肌球蛋白的氨基酸序列進(jìn)行親水性分析,結(jié)果見圖4。兩種同工型的氨基酸基本都顯示了親水性模式。然而,這兩種同工型的氨基酸的親水周期還是有些明顯的不同,比如sc-w相對于 sc-s在第 31-43、55-58、68-70、79-87、141-145和189-195的氨基酸區(qū)域展示了更高的親水性。

圖3 鰱魚、草魚和鯉魚部分輕酶解肌球蛋白的氨基酸序列比較Fig.3 The comparison in the deduced amino acid sequences of partial light meromyosins from silver carp and those of grass carp and common carp

圖4 鰱魚兩種肌球蛋白重鏈同工型基因部分輕酶解肌球蛋白氨基酸序列的親水性分析Fig.4 Hydrophilicity analysis of partial deducedamino acid sequences for light meromyosin from the two types of silver carp myosin heavy chain isoform

我們已經(jīng)在蛋白質(zhì)水平上通過差示掃描量熱儀(DSC)和流變儀對冬季和夏季鰱魚的肌球蛋白熱穩(wěn)定性和凝膠形成特性進(jìn)行了測定,發(fā)現(xiàn)前者的熱穩(wěn)定性明顯低于后者,且兩者之間在凝膠形成模式上顯示了明顯的差異[11];Tao等[25-26]報道了10℃馴化和冬季草魚的肌球蛋白熱穩(wěn)定性較30℃馴化和夏季草魚的明顯要低,彼此之間亦顯示了不同的凝膠形成模式。據(jù)此,可以認(rèn)為不同肌球蛋白重鰱同工型在輕酶解肌球蛋白特定區(qū)域氨基酸殘基上的變異可能導(dǎo)致它們之間在結(jié)構(gòu)上的差異,進(jìn)而引起功能性質(zhì)上的變化。這樣,似乎基于低溫馴化的淡水魚表達(dá)的肌球蛋白重鏈同工型必須在它們的初級結(jié)構(gòu)上發(fā)生某些氨基酸殘基的變異才能有助于其適應(yīng)低溫的棲息環(huán)境。

2.3 分子系統(tǒng)樹分析

我們根據(jù)3種鯉科魚類和兩種溫血動物的骨骼肌、心臟肌或非肌肉組織的部分LMM氨基酸序列構(gòu)建了分子系統(tǒng)樹。由圖5所示,系統(tǒng)樹分為3個主要的分支:一個最大的分支由草魚、鰱魚和鯉魚的骨骼肌、溫血動物雞的成年骨骼肌以及大鼠的心臟肌的肌球蛋白重鏈同工型組成,其自引導(dǎo)值為99%;另兩個分支分別由非脊椎動物的扇貝肌和雞的非肌肉組織的肌球蛋白重鏈同工型組成,它們的自引導(dǎo)值均為100%。在大分支中,3種鯉科魚類的8個肌球蛋白重鏈同工型形成了一個大組,其中,gcI、gc30、sc-s和cc30均從高溫棲息的魚肌肉中分離,因此,它們之間顯示了更近的基因距離;而ccI、sc-w、gc10均從低溫棲息的魚肌肉中分離,它們之間則顯示了近的基因距離。雖然cc10也是來自于低溫馴化的鯉魚,但在這個大組中,它形成了獨(dú)立于其它類型的分支,其自引導(dǎo)值為72%。來自于雞的非肌肉組織的肌球蛋白重鏈同工型與所有其它來自于骨骼肌的肌球蛋白重鏈同工型之間顯示了低的同源性。分子系統(tǒng)樹的分析結(jié)果進(jìn)一步證明了廣溫性淡水魚肌球蛋白重鏈的基因歧化和功能進(jìn)化在很大程度上受棲息環(huán)境溫度的影響。這些結(jié)果完全符合了前人報道的對鯉魚和草魚所作的相關(guān)分析結(jié)果[7,27]。

圖5 根據(jù)鰱魚和其它生物的輕酶解肌球蛋白氨基酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹Fig.5 Phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of partial light meromyosins from silver carp and those of other species

3 結(jié) 語

作者通過RT-PCR法和3′-RACE法從冬季和夏季鰱魚的骨骼肌中分別分離到一種低溫型(sc-w)和一種高溫型(sc-s)肌球蛋白重鏈同工型基因,兩種同工型基因的cDNA序列包含了部分3′-翻譯區(qū)和全部3′-非翻譯區(qū),編碼了鰱魚輕酶解肌球蛋白(LMM)羧基端的一部分氨基酸序列。兩種同工型之間的核苷酸或氨基酸序列之間顯示了較低的同源性;與草魚和鯉魚的各種同工型之間的比對結(jié)果,基本上顯示了來自低溫和高溫棲息環(huán)境的魚其各自肌球蛋白重鏈同工型之間具有更高的同源性,表明了廣溫性的淡水魚必須在它們的肌球蛋白重鏈的初級結(jié)構(gòu)上發(fā)生某些氨基酸殘基的變異才能有助于其適應(yīng)低溫的棲息環(huán)境。分子系統(tǒng)樹的分析結(jié)果進(jìn)一步證明了淡水魚肌球蛋白重鏈同工型的基因距離與它們所棲息的環(huán)境溫度有關(guān)。

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