電致化學發光方法檢測肉的新鮮度

鈕偉民, 孫秀蘭, 張銀志, 李在均, 宋啟軍, 李芳, 周磊

(1.無錫市疾病預防控制中心,無錫21402,2.江南大學食品學院,無錫214122;3.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,無錫214122;4.江南大學化工材料與工程學院,無錫214122)

隨著人們生活水平的不斷提高,肉類消費量日益增大,人們對于肉的品質要求也是不斷提高,如何準確地評定肉品的新鮮程度關系著人們的切身利益。我國對鮮凍畜禽肉的衛生標準都有明文規定,根據衛生標準對肉品新鮮程度的評定主要采用感官標準與理化標準相結合的方法[1]。肉品的變質過程,就是肉品外在感觀性狀和內部成分逐漸腐敗變化的過程,其過程中伴隨著硫化物和氨氣的產生[2]。目前判定肉品新鮮度主要從肉品的感觀性狀、腐敗分解產物的特性及含量、細菌的數量及污染程度三個方面來進行[3-5],但是這些方法往往耗時比較長,設備復雜,而且靈敏度不是很好。本文采取電致化學發光的方法,通過檢測肉類腐敗變化的過程中產生的氨氣,從而來檢測肉的新鮮程度。

電致化學發光(ECL)是某些具有電致化學發光活性的物質處在一定的電位時,與溶液中氧化還原物質作用生成的不穩定激發態遷移回基態時所導致的化學發光[6]。國內外的學者對化學發光法的機制也進行了大量的研究[7-8]。它具有靈敏度高、重現性好、可連續檢測、檢測速度快和裝置簡單等特點。

1 材料與方法

1.1 試劑

鹽酸,N,N′-二甲基甲酰胺(DMF),硝酸均購自中國醫藥公司上海分公司;0.05 mol/L磷酸緩沖溶液和多壁碳納米管(MWNTs)作者所在實驗室自制。

1.2 儀器

GS-3交直流兩用大氣采樣機(上海宏偉環保設備廠);PHS-2ST數顯酸度計,EL-204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);IM6e電化學測試儀(德國ZAHNER公司);MPI2B型多參數電致化學發光/化學發光分析測試系統(西安瑞邁電子科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 MWNTs/PVA/銥配合物修飾電極的制備

MWN T經充分研磨后,在濃硝酸中加熱回流3 h,用超純水洗滌至中性,并在200℃下烘干3 h.稱取2 mg處理過的MWNT,加入10 mL二甲基甲酰胺(DMF),超聲30 min后,MWNT分散于DMF中,形成棕色溶液。玻碳電極修飾前使用0.3 mg氧化鋁粉在拋光絨布上仔細打磨拋光5 min,用超純水沖洗干凈后,置于空氣中晾干.用微量進樣器移取10μL剛剛經過超聲振蕩的MWNT/DMF溶液滴加在電極的工作面上,置于紅外燈下烘干.再移取5μL含0.1%Nation的乙醇溶液滴加于電極的表面,在空氣中晾干,待溶劑揮發完全即可。修飾后的工作電極用超純水沖洗干凈,并保存于室溫下。

1.3.2 樣品處理與測定

將500 g新鮮肉至于密閉的容器里,每放置5小時,采用大氣采樣器抽取密閉容器里的氣體,將采集的氣體樣品導入至10 mL 0.1 mol/L HCl溶液中,采樣速率為0.5 L/min,采樣時間為5 min。將導入氣體的10 mL 0.1 mol/L HCl溶液的p H值調至6.5,以MWNTs/PVA/銥配合物修飾電極為工作電極[9],鉑絲電極為對電極,Ag/AgCl電極為參比電極,進行循環伏安-電致化學發光掃描,掃描范圍為0.2～1.8V,掃描速率為100 mv/s。

2 結果與討論

2.1 掃描速率的影響

研究中發現,循環伏安-電致化學發光的掃描速率影響著體系的發光強度[10]。因此,對同一樣品,采用不同的速率進行掃描,分別為10、50、100、150、200 mV/s,隨著掃描速率的增大,體系的發光強度越來越大,但是超過一定掃描速率之后,發光值不再繼續增大,并且在同一掃描速率下,發光值呈現不穩定的趨勢。

2.2 酸度的影響

在循環伏安-電致化學發光體系中,溶液的p H值對ECL值影響很大[11],隨著p H值的增大,ECL值逐漸增大,當p H值為6.5時,發光達到最大值,隨著p H的繼續增大,發光呈現減小的趨勢(見圖1)。產生上述這種現象,主要原因是由于溶液中的NH4+主要是以NH3的形式參與反應,在溶液中,NH4+和NH3的濃度其實是達到一個有效的平衡,當p H值較低時,主要是以N H4+的形式存在,溶液中的N H3就比較少;當p H值較高時,主要是以NH3的形式存在,但較高的p H使得溶液中的NH3又會溢出。所以,結合實驗,我們選擇最佳的p H值6.5。

2.3 線性范圍及檢出限

在p H為6.5的 PBS溶液中,以100 mV/s的速度在0.5～1.8 V電位范圍內進行循環伏安-電致化學發光掃描,配制一系列的NH4+標準溶液測量用以得到不同濃度NH4+溶液的標準曲線,結果如圖2所示。NH4+作為共反應物的發光值與NH4+濃度在1.8×10-7～1.0×10-9mol/L范圍內呈良好的線性關系,其線性回歸方程為:y=0.701 6x+46.884(R2=0.999 9),檢出限為 1.2×10-13mol/L(S/N=3)。

圖1 pH對修飾電極電致化學發光的影響Fig.1 Effect of pHon ELC

圖2 MWNTs/PVA/(pq)2Ir(N-phMA)修飾電極檢測NH4+的標準曲線,掃描速率100mV/sFig.2 the detection of NH4+with modified electrode assembled with MWNTs/PVA/(pq)2Ir(N-phMA)

2.4 MWNTs/PVA/(pq)2Ir(N-phMA)修飾電極的穩定性與重現性

同一電極平行測定2.0×10-5mol/L NH4+溶液10次,RSD為1.8%(見圖3)。

圖3 修飾電極的重現性Fig.3 Reproducibility of modified electrode

在相同條件下制作的5支電極測定2.0×10-5mol/L NH4+溶液,RSD為2.9%。電極測量完畢后,用蒸餾水清洗電極,室溫下晾干,在4℃下儲存。每隔一周測定1.0×10-5mol/L NH4+溶液,如圖4所示。

圖4 修飾電極的重現性與穩定性Fig.4 Stability of modified electrode

前10周內,測定的 ECL值較為穩定,其 RSD為 2.4%,說明 MWNTs/PVA/(pq)2Ir(N-phMA)修飾電極性能穩定。

2.5 干擾實驗

空氣中含有氮氣﹑二氧化碳﹑硫化氫﹑二氧化硫,腐肉本身也會釋放出硫化氫[12]。為了檢驗上述這些物質對氨氣的檢測是否有干擾,我們做了如下的干擾實驗:(1)往p H為6.5的 PBS溶液中通氮氣5 min;(2)往p H為6.5的PBS溶液中通硫化氫5 min;(3)往p H為6.5的PBS溶液中通二氧化碳5 min;(4)往p H為6.5的PBS溶液中通二氧化硫5 min,將制備的 MWNTs/PVA/(pq)2Ir(N-phMA)修飾電極分別插入上述4份溶液,進行電致化學發光掃描,結果發現,上述溶液均未能產生化學發光,這也就說明采用電致化學發光法來檢測空氣中氨氣時,其它成分的存在不會對其測定產生干擾作用。

2.6 肉類新鮮程度的測定

當肉由于各種微生物的污染和作用引起了腐敗現象,或者由于自身酶的分解作用引起酸臭性發酵時,會產生硫化物和其他揮發性物質如氨氣,因此可根據肉類在不同時期產生氣體釋放的程度,通過采集不同時期的氣體樣品用于新鮮度的檢測(見圖5)。

從ECL數據顯示,當新鮮肉剛剛放入密閉空間時,采集樣品,我們并沒有檢測到發光,放置5 h之后,我們檢測到 ECL,說明此時豬肉自身酶開始分解,釋放出氨氣,隨著放置時間的增加,ECL響應值逐漸增大,說明豬肉腐化釋放的氨氣越來越多,豬肉的腐化越來越嚴重。當放置超過兩天后,ECL值增至200,根據我們所作的標準曲線,采樣速率以及采樣的時間,我們可以計算出各個時間段氨氣的濃度(如圖6)。

圖5 樣品檢測,每5 h進行一次采樣和掃描,掃描速率100 mV/sFig.5 Sample detection,scanning once every 5 hours,the scanning rate of 100 mV/s

3 結 語

圖6 氨氣濃度隨儲存時間的變化Fig.6 Concentration of NH3changed with storage time

肉品腐敗是一個非常復雜的物理化學過程,傳統的肉新鮮度檢測方法也比較多,但是都有一共同的缺點,都要求在檢測前先制備肉浸液,過程繁瑣且耗時較長,難以滿足快速檢測的要求。而用電致化學發光法檢測肉的新鮮度,可以省去肉的預處理步驟,大大縮短了檢測的時間,而且此方法還具有靈敏度高和檢測結果穩定的特點,操作簡便的特點,適宜于推廣使用。

[1]薛慧文.肉品衛生監督與檢驗手冊[M].金盾出版社,2003.440.

[2]孫鐘雷.電子鼻筑術在豬肉新鮮度識別中的應用[J].肉類研究.2008,108(2):50-53.SUN Zhong-lei.Application of electronic nose technology in pork freshness recognition[J].2008,108(2):50-53.(in Chinese)

[3]Ivo Frebort,Lenka Skoupa,Pavel Pec.Amine oxidase-based flow biosensor for the assessment of fish freshness[J].Food Control,2000:13-18.

[4]G Vinci,M L Antonelli.Biogenic amines:quality index of freshness in red and white meat[J].Food Control,2002:519-524.

[5]陳家華.畜禽及其產品質量和安全分析技術[M].化學工業出版社,2007.81.

[6]管文軍.電致化學發光生物檢測技術的新進展[J].分析化學.2004,32(3):402-406 GUAN Wen-jun.The new progress in electrochemiluminescence bio-detection technology[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2004,32(3):402-406.(in Chinese)

[7]Lai,Rebecca Yun Kay.Electrogenerated chemiluminescence of phenylquinoline-phenothiazine donor-acceptor molecules,dipyrromethene-boron fluoride laser dyes and bent-pyrene-containing cyclophanes[J].Dissertation Abstracts International,65-01,Section:B,0194

[8]Choi,Jai-Pil.Electrogenerated chemiluminescence with amine and benzoyl peroxide coreactants:Reactivity and reaction mechanism studies[J].Dissertation Abstracts International,64-12,Section:B,6057

[9]eleke,Abisake.Determination of cholesterol in foods by flow injection analysis with perroxyoxalate chemiluminescence[J].Masters Abstracts International,:44-06,:2798

[10]陶穎.多壁納米碳管在固態電致化學發光中的應用研究[J].廈門大學.2007:24 TAO Yin.The studies and applications of carbon nanotubes in solid-state electrochemiluminescence[J].Xiamen Univercity,2007.24(in Chinese)

[11]陳毅挺,何偉文,林棋,等.基于多壁碳納米管修飾電極的保泰松的電致化學發光檢測[J].化學學報,2009,(67):1615-1620 CHEN Yi-ting,He weiwen,Lin qi,et al.Electrochemiluminescence determination of phenyIbutaz one based on modified electrode by multi-wall carbon nanotube[J].ACTA CHIMICA SINICA,2009(67):1615-1620(in Chinese)

[12]張敬平,鈕偉民,葉扣貫.肉類分解產物及檢測現狀[J].中國衛生檢驗雜志,2006(16):1405-1408 ZHAN Jing-ping,NIU Wei-min,YE Kou-guan.Decomposition products of meat and testing status[J].Chinese Journal of Health Laboratory Technology,2006(16):1405-1408(in Chinese)