糖酯酶促合成轉化率的影響因素分析

劉巧瑜, 張曉鳴

(1.仲愷農業工程學院輕工食品學院,廣州510225;2.江南大學食品學院,無錫214122)

糖酯是以碳水化合物分支為親水基團,一個或多個脂肪酸作為疏水基團組成的酯類化合物。糖酯分子中同時具有親油和親水基團,是一類典型的非離子型生物表面活性劑。糖酯的 HLB值為1～16,可做水包油型(O/W)和油包水型(W/O)乳化劑[1]。目前糖酯廣泛應用于食品[2-3]、醫藥[2]、發酵[3]、化妝品[4]、洗滌劑[5]、化肥[3]等領域 ,也可作為無熱量脂的代用品[6],一些糖酯及其衍生物還具有抑菌、抗病毒和抗腫瘤等活性[7-8]。近年來,全球僅蔗糖酯和葡萄糖酯的年產量就達到了6 000噸[9]。

化學合成是糖酯工業生產中目前采用的唯一方法。由于化學合成的糖酯色澤深、純度低、有一定毒性[10],目前正在研究取代糖酯化學合成的方法,其中酶促合成法最常用。根據反應機理的不同,酶法合成糖酯的反應主要有糖與脂肪酸的酯化反應[11]及糖與脂肪酸酯的轉酯化反應[12],其中轉酯化反應可分為醇解、酸解和酯交換等3種類型。影響糖酯酶促合成轉化率的因素很多,其中主要有以下6個方面。

1 糖酯酶促合成反應器

根據操作方式不同,糖酯酶促酯化反應器可分為間歇式反應器和連續式反應器。

1.1 間歇式反應器

間歇式反應器在反應過程中沒有底物的補充和產物的導出,底物和產物的濃度隨反應時間的變化而變化,僅適用于多品種、小批量、反應速率慢的反應過程。目前對酶催化合成糖酯的工藝研究尚處于探索階段,酶促合成糖酯時大多選用間歇式反應器[13-15]。

1.2 連續式反應器

連續式反應器以一定的流量不斷補充新鮮的底物,同時以相同的流量不斷地導出反應液,使反應連續穩定進行。連續反應器可克服間歇反應器因底物消耗或產物積累所導致的反應只能在有限時間內進行的缺點,可提高生產效率,是實現糖酯酶法合成工業化的有效途徑[16]。根據流體混合方式的不同,典型的連續反應器可以分為連續攪拌式反應器(ContinuousStirredTankReaction,CSTR)和連續活塞式反應器(Continuous Plug Flow Reactor,CPFR)或填充床反應器(Packedbed Reactor,PDR)[17]。

糖在有機溶劑中的溶解度通常較低,為維持盡量高的酯化速度,反應器中的糖往往過量。只有溶解于溶劑中的糖才能更好地與酸和酶接觸,并參與酯化反應。連續攪拌可促進糖的溶解,加快傳質速度,故CSTR是在有機溶劑中酶促合成糖酯時優先選擇的反應器。目前,已采用CSTR連續或半連續合成了曲酸月桂酸酯[18]、麥芽糖月桂酸單酯[19]和抗壞血酸飽和脂肪酸酯[20]等糖酯。

不同的糖在有機溶劑中的溶解度差異極大,故有人采用 PDR作為糖酯酶促合成的反應器。用PDR連續合成不同鏈長的脂肪酸抗壞血酸酯時,產物的轉化率可達 14%～17%,整個反應可持續10d[21]。PDR還成功地合成了脂肪酸赤蘚糖酯[21]及甘露糖等己糖脂肪酸酯[22]。

2 反應體系

底物和酶的良好接觸是酯化反應正常進行的基本條件,因此需選擇合適的介質將底物與酶盡量制備成均相體系。常用作糖酯酶促合成反應的介質體系主要有以下3種。

2.1 有機溶劑體系

有機溶劑易產生微水環境,抑制酶的水解活性,是酶促合成糖酯時最常用的反應介質。水溶性的和非水溶性的有機溶劑均可作為酶促合成糖酯的反應介質,但對酶的性質和酯化反應速度有不同的影響。丙酮、乙腈和叔丁醇等水溶性溶劑有利于糖等親水性底物的溶解,但可能攫取酶分子中保持其催化活性所必需的水,降低酶的活性,甚至使其失活[23-24]。甲苯、己烷和異辛烷等非極性溶劑有助于保持酶的催化活性,但不利于糖的溶解,酯化反應速度極緩慢[25]。有機溶劑的極性對產物的平衡轉化率也有一定的影響。以脂肪酶催化合成木糖油酸酯時,將溶劑由叔丁醇換成己烷后,二酯和三酯的平衡轉化率均降低,而單酯的轉化率提高[26]。

不同的酶和底物的性質不同,因此用不同的酶催化合成糖酯時需選用不同的有機溶劑。豬胰脂肪酶在吡啶中可催化三氯乙醇脂肪酸(C2～C12)與葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖的酯化,枯草桿菌蛋白酶可在吡啶或二甲基亞砜(DMSO)中催化蔗糖、麥芽糖、乳糖和纖維二糖或麥芽三糖～麥芽七糖等的酯化反應[27]。

由于糖和脂肪酸的溶解特性差異極大,單一的有機溶劑很難將兩者制備為均一的體系。將兩種有機溶劑混合,盡管有利于糖和脂肪酸的溶解,但可導致溶劑分子極性的改變,從而影響糖酯的轉化率,如木糖油酸二酯的轉化率隨著溶劑極性的下降而增大[26]。為促進酶與底物的接觸,可對底物或酶進行一定的前處理,目前常用的方法主要有:

1)糖修飾法。將糖經過一定的修飾,增大其在溶劑介質中的溶解度,可提高糖酯的酶促合成速度。常用的糖修飾法有縮酮式和烷基糖苷式。縮酮式修飾的糖酯化后,需在溫和的酸性條件下脫去丙酮叉,才能得到相應的糖酯。該法可提高糖酯的產率,但需進行丙酮叉基團引入和脫除反應,在一定程度上增大了糖酯合成過程的復雜性[28]。引入烷基修飾基團的反應很簡單,且一些酶促反應的產物本身就是良好的表面活性劑,無需再脫去修飾基團,因此較縮酮式修飾更有應用前景[27]。

2)硼酸-糖復合物法。糖與有機硼酸能形成可溶于多種非極性有機溶劑的硼酸-糖復合物,該復合物酯化后在極溫和條件下水解即可得到相應的糖酯。例如,葡萄糖與苯基硼酸形成的苯基硼酸-葡萄糖復合物在叔丁醇中用脂肪酶催化,可與乙烯酯、脂肪酸或植物油發生酯化或轉酯反應,得到轉化率較高的糖酯[27]。

3)酶或糖的固定化。將酶或糖固定化可促進酶與糖的充分接觸,提高酯化反應的速度和糖酯的轉化率。將單糖固定在硅膠上,然后用來自于南極假絲酵母菌(Candida antarctica)和皺褶假絲酵母菌(C.rugosa)的兩種脂肪酶催化合成月桂酸糖酯,均可提高糖酯的轉化率,同時均100%的在6-OH位上?；痆29]。將脂肪酶和單糖共同吸附于親水性硅膠上,還可破壞糖的晶體結構,便于糖擺脫晶格的束縛而進入酶的活性中心,增強糖與酶的接觸,從而提高糖酯的轉化率[30]。

2.2 無溶劑體系

無溶劑體系(Solvent-free System)不使用或僅使用少量的有機溶劑,可避免溶劑對酶和產品使用安全性的影響?！肮?固”反應體系(Solid to Solid System)是酶促合成糖酯反應中一種常用的無溶劑體系[27],主要由不溶的反應物和產物組成。在無溶劑體系中,酶促反應仍在液相中進行,因此液相的形成對“固-固”反應體系至關重要[27]。反應過程中,部分底物首先溶解于液相中,然后在酶的催化下生成產物。由于液相的體積很小,生成的產物很快從液相中析出,從而推動反應的持續進行[31]。液相主要通過添加微量的在反應溫度條件下呈液態的“助溶劑”形成,它的作用是將糖和酸制備成均勻的溶液體系[32]。

助溶劑通常是水、有機溶劑或水與有機溶劑的混合物。一定量的助溶劑可改善液相的組成,調節液相的體積、粘度、組成和各組分的比例及固相在液相中的分散量和分散程度,可提高反應速度和產物的產率。在酯化反應后期,由于產物的大量析出,混合物固化現象明顯,傳質受到限制,酯化反應速度降低,添加助溶劑可明顯提高反應速度[27]。助溶劑的lgP值對酯化反應的轉化率和產物的產率具有重要影響,極性較強的助溶劑可促進糖的溶解和產物的析出,從而有利于反應的進行[31]。

2.3 離子液體

離子液體(Ionic Liqiuds)是由有機陽離子和無機或有機陰離子構成的低熔點鹽類,在室溫或較低溫度(<100℃)下呈液態。離子液體是一種非水相的溶劑,具有不揮發、對熱和化學反應穩定及對環境友好等特性。離子液體的極性、疏水性、粘度和溶解性可通過對陽離子和陰離子的適當修飾來調節。葡萄糖和蔗糖在以1-烷基-3-甲基咪唑為陽離子的離子液體中的溶解度遠大于在叔丁醇中的[27]。與有機溶劑相比,離子液體可提高乙酸葡萄糖酯的酯化選擇性[33]。

3 水分含量

水在糖酯酶促合成反應中具有雙刃劍的作用[34]。一方面,靠近或結合于酶活性中心的水是酶的必需水分,有利于保持酶的酯化催化活性,水也可促進糖的溶解。另一方面,水又是酯化反應的副產物,水的大量生成可降低酯化反應速度,甚至促進酯化物的水解,還可能降低酶的酯化催化活性[9,35]。

及時脫除反應中產生的水可提高酯化反應速度。常用的脫水法有吸附劑吸附脫水法[13,36-37]、共沸蒸餾法[38]、真空脫氣法[39]和蒸發法[9]。吸附劑法操作簡單,吸水劑可重復使用,是糖酯合成研究中最常用的方法[36]。硅膠和分子篩是最常用的兩種脫水劑。相對而言,分子篩具有高效的吸附性和很高的化學穩定性,且成本低廉,容易分離和再生,故常用作糖酯酶促合成反應中的脫水劑[13,36],但分子篩也具有一定的催化和化學吸附作用,可能促進不穩定底物的降解以及二酯的形成等酯化反應的副反應的發生[36]。蒸發法可連續操作,故可用于糖酯的酶促工業化生產中[9]。

4 反應溫度

提高反應溫度可提高底物的溶解度、降低溶液的粘度,加快傳質過程,促進底物與酶的有效接觸,加快化學反應的速度[37]。酶的催化活性也與溫度密切相關[38]。固定其它反應條件,僅改變反應液的溫度,在離子液體[60%(BMIM)(BF4)+40%叔丁醇]中用Nov435脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸單酯時,40、50和 60℃時月桂酸的轉化率分別為18%、60%和11%[33]。底物對最適酯化反應溫度也有一定的影響,如在上述體系中以 C6、C10和C12酸合成葡萄糖酸酯時,60℃時的轉化率明顯地較50℃時的高[33]。在幾乎無水的有機介質中,酶尤其是固定化酶可維持其剛性構象而具有更高的熱穩定性,可耐受更高的溫度,故酶促合成糖酯時的溫度較水解反應的高[30]。

5 底物

不同鏈長的脂肪酸中電子和原子的空間排列不同,因此可影響糖酯的轉化率[39-40]。受脂肪酸碳鏈上電子密度的影響,以非共軛酸為底物酶促合成糖酯時的最大速度與米氏常數的比值(Vmax/Km)約比共軛酸的高10倍[39];直鏈脂肪酸的約比支鏈脂肪酸的高10倍[40]。以C4～C12的脂肪酸為底物,在叔丁醇和嘧啶(9:11,v/v)組成的混合介質中用Nov 435催化合成蔗糖酯時,初始酯化速度和糖酯的產率隨著脂肪酸鏈長的縮短而上升[33]。

由于只有溶解于溶劑的糖才能有效地參與酯化反應,而不同的糖在有機溶劑中的溶解度不同,因此糖也可對酯化反應速度產生重要的影響。如30℃時,葡萄糖在2-甲基丁醇中的溶解度約是蔗糖的3倍[41],以2-甲基丁醇為溶劑合成棕櫚酸糖酯時,葡萄糖棕櫚酸單酯的轉化率遠高于蔗糖棕櫚酸單酯的[7]。麥芽糖在有機溶劑中的溶解性較蔗糖好,當反應條件相同時,麥芽糖的酯化速度和轉化率均較蔗糖的高[41]。

6 酶

用于催化糖酯合成的酶主要有脂肪酶和蛋白酶等水解酶。脂肪酶可通過催化酯化反應和轉酯化反應合成糖酯,其中最常用的脂肪酶有來源于南極假絲酵母菌(C.antarctica)的游離脂肪酶(CALB)及固定化脂肪酶(Nov 435)[36]、來源于念珠假絲酵母菌(C.cylindracea)的脂肪酶(CCL)以及豬胰脂肪酶(PPL)[33]。蛋白酶一般通過催化轉酯化反應合成糖酯,主要有來源于桿菌屬(Bacillus)的堿性蛋白酶,它們可在極性較強的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和吡啶等有機溶劑中催化糖酯的合成[27]。α-糜蛋白酶也可在無溶劑體系中催化合成苯丙氨酸葡萄糖酯[42]。常見的催化糖酯合成的酶的種類與來源見表1[27]。

表1 常見的催化糖酯合成的酶Tab.1 Enzymes usually used in enzymatic synthesis of sugar esters

不同來源的脂肪酶在結構上具有明顯差異,部分脂肪酶的結構特征參數見表2[43]。由于活性中心等結構上的不同,不同脂肪酶具有不同的酯化催化活性。以Nov 435、Lipozyme IM以及來自假單胞菌(Pseudomonas)和皺褶假絲酵母菌(C.rugosa)的脂肪酶催化乳酸和辛酸合成糖酯時,僅Nov 435催化的反應體系中有糖酯的生成[44]。

酶的酯化催化活性及選擇性與酶的來源有關,還可能受到反應介質和底物等的影響[45]。高LogP值的溶劑有利于保持脂肪酶的酯化催化活性[40]。在含20%二甲亞砜的2-甲基丁醇中,以棕櫚酸乙酯為底物催化合成麥芽糖酯時,Nov 435催化的平衡轉化率高于固定化嗜熱真菌(T.lanuginosus)脂肪酶催化的,但后者的初始轉化率較前者高[7]。與脂肪酶相同,蛋白酶的酯化催化活性與選擇性也依賴于溶劑的性質。在同樣的反應條件下,堿性蛋白酶在嘧啶中表現出極高的酯化催化活性,而在叔丁醇和甲苯中無酯化催化活性[46]。

表2 部分脂肪酶的結構特征參數Tab.2 Structural characterisc parameters of some lipases

酶的固定化或修飾可提高酶的酯化催化活性、穩定性和選擇性。酶的固定化有利于提高酶在有機溶劑中的分散性,促進底物與酶活性位點的充分接觸,還有利于酶的回收和再利用。由于不同的固定酶的載體具有不同的表面結構,故酶與載體的結合方式和結合位點不同,從而對固定化酶的活性和選擇性產生一定影響[47-48]。用表面活性劑修飾也可提高酶在有機溶劑中的催化活性和穩定性,部分脂肪酶用葡萄糖修飾可提高其熱穩定性[49]。

3 結 語

糖酯酶促合成中,反應器、反應體系、水分含量、反應溫度、底物和酶是影響糖酯酶促合成轉化率的六大因素。糖酯酶促合成技術在食品及相關領域的研究目前已有很多報道,但大都還處于應用基礎研究階段,糖酯酶促合成的工業化嘗試還不多。隨著新型反應器的應用,反應體系的建立,酶性質的優化和成本的降低,酶法清潔生產的優越性必將促進糖酯酶促合成的突破性發展。

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