微生物酪氨酸解氨酶的研究進(jìn)展

張峰, 曾化偉, 廖祥儒, 蔡宇杰, 童超

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫214122;2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫214122)

次生代謝物質(zhì)對醫(yī)藥、輕工、化工、農(nóng)藥等領(lǐng)域的發(fā)展具有不可替代的地位。其來源包括植物的次生代謝與化學(xué)合成。植物來源具有栽培周期長、產(chǎn)量不高、不可再生等缺點(diǎn),難以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn);化學(xué)合成需要大量的能源,成本高,且造成環(huán)境污染。目前國內(nèi)已報(bào)道了一些利用微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥等的次生代謝物質(zhì)如竹紅菌素、蝦青素、白藜蘆醇[1-3]。微生物轉(zhuǎn)化具有高效、高產(chǎn)、高強(qiáng)度、地成本,且不受季節(jié)、氣候、地域等自然條件的限制,因此具有植物生產(chǎn)與化學(xué)合成不可比擬的優(yōu)勢,極具開發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值。

在植物苯丙氨酸代謝途徑中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙氨酸代謝的第一步反應(yīng)的酶與關(guān)鍵酶,PAL通過非氧化脫氨將L-苯丙氨酸(L-Phe)轉(zhuǎn)化為肉桂酸,再經(jīng)肉桂酸-4-羥化酶(C4H)轉(zhuǎn)化為香豆酸,再由4-香豆酰-CoA-聯(lián)結(jié)酶(4CL)、查爾酮合成酶(CHS)等催化形成黃酮類化合物,或者經(jīng)芪合酶(STS)催化為白藜蘆醇等芪合物(見圖1)。

圖1 植物苯丙氨酸代謝途徑Fig.1 Metaolic pathway of phenylalaninie in plant

但目前已知的微生物中沒有發(fā)現(xiàn)C4H和次生代謝物質(zhì)的前體物質(zhì)香豆酸[4],限制了由苯丙氨酸代謝途徑生物轉(zhuǎn)化生成代謝物質(zhì)。TAL能不經(jīng)C4H進(jìn)行非氧化脫氨,直接將L-酪氨酸(L-Tyr)轉(zhuǎn)化為香豆酸,因此研究人員對 TAL產(chǎn)生了極大的興趣。目前發(fā)現(xiàn)的 TAL同時也具有PAL活性,已知植物 TAL對L-Tyr的親和性都遠(yuǎn)低于L-Phe。近年來,在幾種微生物中發(fā)現(xiàn)的 TAL對L-Tyr有較高的親合力,經(jīng)海藻酸鈣固定 TAL基因重組的大腸桿菌,在125 L的生物反應(yīng)器中以L-Tyr為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化,純化到了12 kg的香豆酸[5],這為該酶的利用于微生物轉(zhuǎn)化提供例證。

1 酪氨酸解氨酶的生物資源

目前發(fā)現(xiàn) TAL存在于高粱、大麥、小麥、燕麥,水稻、玉米、甜甘蔗、歐芹等單子葉植物[6-7]。早在1968年,Bandoni等[8]報(bào)道了在擔(dān)子菌中存在 TAL的活性。近年來,報(bào)道了不同微生物來源的 TAL的酶學(xué)性質(zhì)。

2002年,Kyndt等[9]首次在莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)分離到 TAL基因,基因表達(dá)于重組大腸桿菌中。純化的TAL與L-Tyr和LPhe反應(yīng)的最適p H值分別為8.5和9.4,與L-Tyr反應(yīng)的轉(zhuǎn)化量(Kcat)、催化效率(Kcat/Km)的值分別是L-Phe的2倍和150倍。

2006年,Kevin等[10]克隆到來源于(Rhodobacters sphaeroides)的 TAL基因,將該基因表達(dá)與大腸桿菌中,該酶與 Kyndt等[9]報(bào)道的Rhodobacter capsulatusTAL的氨基酸序列的同源性高達(dá)56%。經(jīng) SDS-PAGE純化后,該酶分子量為55 000,與L-Tyr反應(yīng)的最適p H值為 8.5～9.0,Kcat/Km是其與L-Phe反應(yīng)的273倍,Kcat幾乎相等。

2006年,Berner等[11]克隆到放線菌(S accharothrix espanaensis)的 TAL基因,在大腸桿菌中表達(dá)并純化。該酶以L-Tyr為底物,p H值低于8.5時反應(yīng)速率下降,p H值8.5以上時仍具有較高的反應(yīng)速率,Km接近于 Kyndt等[9]報(bào)道的Rhodobacter capsulatuTAL,Kcat低于Rhodobacter capsulatuTAL。該酶以L-Tyr為底物的Kcat/Km是與L-Phe為底物的750倍,這個值是目前已報(bào)道最高的。

2007年,Vannelli等[12]從多種細(xì)菌和真核生物中分離出粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)的TAL,測定了該酶具有較高的胞內(nèi)酶活力(0.014 3 U/mg蛋白)和最低的PAL/TAL活性比系數(shù)(1.68)。克隆該基因并表達(dá)于大腸桿菌中,純化該酶的相對分子質(zhì)量為287 000。

2007年,Vannelli等[13]測定9種真菌的以LTyr誘導(dǎo)的胞內(nèi) TAL活性,其存在于絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)有最高的酶活性(0.179U/mg蛋白),但具有最低的 PAL/TAL活性比系數(shù)(0.8)。該酶純化后研究表明,其相對分子質(zhì)量為294 000的同源四聚體結(jié)構(gòu),亞基相對分子質(zhì)量73 500,等電點(diǎn)為5.8,根據(jù)其N端和部分內(nèi)部氨基酸序列,克隆了編碼該酶的cDNA。cDNA序列分析表明,該序列于其他8種真菌的序列具有56%～62%的同源。

2007年,Xue等[14]測定4種微生物的以L-Tyr誘導(dǎo)的胞內(nèi) TAL活力,其中(Phanerochaete.chrysosporium)具有較高的酶活力(1.25U/g)。將TAL基因表達(dá)于大腸桿菌后用SDS-PAGE純化,該酶相對分子質(zhì)量為70 000,以L-Tyr為底物的Kcat/Km略高于以L-Phe為底物的Kcat/Km,PAL/TAL活性比系數(shù)為(0.7)。因該真菌能在較高溫度下生長,據(jù)此推測該酶具有較好的熱穩(wěn)定性,研究表明在60℃高溫下,3 h保持全酶的活力,4 h酶活力仍然可達(dá)72%。

2 酪氨酸解氨酶晶體結(jié)構(gòu)研究

TAL與 HAL、PAL都屬于芳香族解氨酶家族。2006年,Louie等[15]用 x射線探測了Rhodobacter sphaeroidesTAL(RsTAL)晶體的3級與 4級結(jié)構(gòu),其與以前報(bào)道的惡臭假單胞菌HAL、歐芹和酵母 PAL晶體結(jié)構(gòu)類似。222對稱點(diǎn)形成了同源四聚寡體,同源四聚體包含4個活性位置。3個不同單體參與構(gòu)成活性位置的空腔,每個單體主要被5個自上而下螺旋狀束有機(jī)圍繞。束的肽鏈N端區(qū)域帶3,5-二氫-5-次甲基-4H-咪唑-4-酮(MIO)輔酶,肽鏈另一端的C端部分構(gòu)成了α螺旋外層,C端區(qū)域與中間的亞基相連并對同源四聚體起穩(wěn)定作用和提供相連單體的活性空腔的外環(huán)。螺旋狀束側(cè)翼區(qū)連有凸出的發(fā)夾環(huán),發(fā)夾環(huán)與第4和第5個螺旋束相連,側(cè)翼區(qū)對單體與單體接口形成起作用。

RsTAL與惡臭假單胞菌 HAL缺少鍥入到C端區(qū)域的附加區(qū),歐芹和酵母PAL存在這個附加區(qū),目前附加區(qū)的功能還不清楚。RsTAL與惡臭假單胞 HAL、真核的歐芹和酵母PAL多肽鏈的主鏈殘基分別有34%、29%、30%一致。RsTAL與惡臭假單胞菌HAL的結(jié)構(gòu)較真核PAL有更高相似,這與主鏈殘基表現(xiàn)一致。

3 酪氨酸解氨酶的反應(yīng)機(jī)制

TAL與 HAL、PAL都屬于芳香族解氨酶家族,HAL和PAL的脫氨基催化反應(yīng)有2種機(jī)制,一種被稱為E1cB機(jī)制,底物的α氨基團(tuán)與MIO的亞甲基碳直接發(fā)生親核加成,另一種機(jī)制被稱為Friedel–Crafts機(jī)制,富有電子的底物芳香環(huán)攻擊引起了MIO的亞甲基碳電子的缺失[16]。

2006年,Louie等[15]用 X射線沒能觀察到RsTAL晶體中的L-Tyr轉(zhuǎn)換,通過對RsTAL與香豆酸、咖啡酸、肉桂酸形成的復(fù)合體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究得到了以L-Tyr為底物的交聯(lián)模型。在MIO亞甲基鍵長內(nèi),L-Tyr芳香碳環(huán)發(fā)生相當(dāng)大平移,平移破壞α羧酸和羥基與 TAL形成的相互作用,這是Friedel– Crafts機(jī)制。另一方面,雖然在模型中L-Tyr的α氨基遠(yuǎn)離MIO輔酶,但丙烯酸基適度的構(gòu)象變化將決定α氨基攻擊MIO亞甲基碳的位置。如果α氨基攻擊MIO亞甲基碳,氧空腔的水介導(dǎo)質(zhì)子化和新形成的Asn203側(cè)鏈酰胺的相互作用可能穩(wěn)定MIO羰基氧的負(fù)電荷。通過對 TAL與AIP抑制劑形成的共價(jià)體進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)多肽鏈殘基194到205的重排使Asn203明顯接近MIO輔酶。但對突變體RsTAL H89F與AIP抑制劑的共價(jià)體進(jìn)行結(jié)晶學(xué)觀察,不足以支持了a氨基的直接攻擊MIO亞甲基碳。因此這個模型基本上支持了Friedel– Crafts機(jī)制,但對 E1cB機(jī)制仍不能肯定。

4 酪氨酸解氨酶基因在次生代謝基因工程中的研究

目前已知的微生物中沒有發(fā)現(xiàn)C4H和次生代謝的前體物質(zhì)香豆酸[1],這限制了微生物通過苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)。為了開辟次生代謝產(chǎn)物嶄新的來源,科研人員將 TAL基因重組于微生物體內(nèi)并成功獲得了香豆酸、黃酮類、反式咖啡酸。

2007年,Vannelli等[12]將來源于Rhodotorula glutinisPAL/TAL基因整合在缺少C4HP-450基因及P-450還原酶且能產(chǎn)L-Phe的大腸桿菌中,實(shí)現(xiàn)了由 TAL途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化為香豆酸。2007年,Xue等[10]將來源于Rhodotorula glutinisTAL基因在大腸桿菌中表達(dá),TAL將L-Tyr轉(zhuǎn)化為香豆酸,該酶催化效率很低,但沒有發(fā)現(xiàn)催化效率更高的TAL。抗高溫的酶能通過提高溫度而具有更高催化效率,隨后發(fā)現(xiàn)了具有抗高溫的Phanerochaete.chrysosporiumTAL,實(shí)驗(yàn)證明隨溫度的升高能產(chǎn)更高的香豆酸。

2004年,Watts等[17]將克隆于Rhodobacter sphaeroidesPAL/TAL基因與4CL基因、CHS基因共同表達(dá)于大腸桿菌中,測得柚皮素的含量高達(dá)20.8mg/L。2005年,Jiang等[18]首次將克隆于Rhodosporidium toruloidesTAL基因與4CL、CHS基因共同表達(dá)于啤酒酵母中,測得柚皮素含量為7mg/L,生松素含量為0.8mg/L,另外還獲得了根皮素、2′,4′,6′-三羥基二氫查耳酮。

2006年,Berner等[11]將克隆于S accharothrix espanaensis的 TAL基因與 EC、CoA基因在大腸桿菌中共同表達(dá)獲得了反式咖啡酸。

5 問題與展望

雖然TAL酶存在于微生物中,TAL基因在微生物次生代謝基因工程研究中已經(jīng)取得一定成果,但目前該酶應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化仍純在一些問題,如酶活性、催化效率還有待于提高。隨著進(jìn)一步對TAL微生物資源的挖掘,酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu),催化機(jī)制的深入研究,經(jīng)過酶的結(jié)構(gòu)修飾(如 KevinT等[10]對RsTAL突變體的研究發(fā)現(xiàn),TAL對L-Phe和LTyr為底物的選擇,單一的決定于His89,PAL獲得該殘基位點(diǎn)后也具有 TAL活性。)、基因重組、基因突變、酶的固定化、發(fā)酵工程的中游下游技術(shù)等的綜合應(yīng)用,TAL服務(wù)于微生物轉(zhuǎn)化具有廣闊的前景。

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