馬糞海膽生殖腺粗多糖提取工藝研究

牛宗亮,王榮鎮,董新偉,郭承華

(煙臺大學 化學生物理工學院,山東 煙臺 264005)

海膽是一種低等的海洋無脊椎動物,屬于棘皮動物門(Echinodermata) 海膽綱(Echinoidea)。中國黃渤海海域常見的海膽有 5種,包括馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)、紫海膽(Anthocidaris crassispina)、海刺猬(Glyptocidaris crenularis)、中間球海膽(Strongylocentrotus intermedius)和光棘球海膽(Strongylocentrotus nudus)[1]。目前,國內外對海膽資源利用不夠充分,綜合開發利用水平較低。對海膽資源一般局限于其生長習性、基因的結構、規律、功能、物種系統進化、受精卵的發育以及海膽用于食品保健等方面的研究[2~5],但對其活性物質研究較少。Murata 等[1]使用反相高效液相色譜測定了馬糞海膽的一種氨基酸—pulcherrimine; 美國學者Biermann[6]對海洋模式生物—光棘球海膽種系發生和進化的進行了深入的研究; 韓國學者 Youn-Ho Lee[7]對光棘球海膽的系統進化和分歧進化時間進行了研究; 海膽多糖可以通過免疫調節和抗氧化途徑,達到抗腫瘤作用[8]; 劉純慧等[9]在光棘球海膽中成功分離出幾種多糖純品,并做了抗腫瘤和免疫活性的研究,對馬糞海膽生殖腺多糖的制備未見報道。

傳統多糖提取方式一般為高溫水提,作者以馬糞海膽生殖腺粗多糖得率為指標,研究提取溫度、提取時間、料水比、提取次數 4個因素對馬糞海膽生殖腺粗多糖提取的影響,采用 L9(34)正交實驗法研究馬糞海膽生殖腺粗多糖提取工藝,為生產提供理論依據。

多元線性回歸 (Multiple linear regression)方法是實驗中一個常用的方法,回歸方程如下所示：

在方程中Y是性質,也就是因變量,X1到Xn代表不同的描述符,b1到bn代表這些描述符的系數,b0是方程的截矩。本方法是在SPSS軟件中運行。

多元線性逐步回歸分析的優點,在于能在為數眾多的變量中,經過篩選找出較為重要的因子,以建立對觀測數據最優化的回歸方程。所謂最優化的方程具有以下兩方面的意義: 一方面,為了預報精確,希望在最終的回歸方程中包含了盡可能多的因素,特別是那些對Y有顯著作用的因素不能遺漏; 另一方面,為了使用方便,又希望預報方程中包含盡量少的變量,況且若方程中包含對因變量根本不起作用或作用很小的量,那么剩余平方和不僅不會由于這些變量而減少多少,相反由于(剩余) 自由度的減少,剩余方差反而有可能增大。同時,這些對因變量影響不顯著的變量,也會影響回歸方程的穩定性,使回歸方程的效果降低[10]。

1 材料、儀器與試劑

馬糞海膽為市售,2009年4月購于煙臺紅利海鮮市場。主要儀器：20PR-520型冰凍離心機(日本Hitachi Koki有限公司); R-205旋轉蒸發器(鄭州長城科工貿有限公司); DZF-6020型真空干燥箱(上海博迅實業有限公司); T6新世紀型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司); 所有試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 正交實驗方案

影響多粗糖提取的主要因素為提取溫度、提取時間、料水比、提取次數,故選用這 4項為考察因素,每個因素擬定 3個水平。選用 L9(34)正交表(表1),共做9組實驗。

表1 4因素3水平正交實驗表Tab.1 The orthogonal experimental design chart with four variables and three levels

2.2 正交實驗

取新鮮馬糞海膽生殖腺,粉碎,使用等量丙酮浸泡,8 h后,倒出上層丙酮,反復4次,收集殘渣減壓濃縮,真空干燥至恒重,經上述步驟除去脂類等雜質[11]。取干燥至恒重的殘渣9份,每份1g,放入100 mL提取瓶中,按正交方案提取。正交實驗中每次倒出的提取液經7 000 r/min離心10 min,收集上清液,沉淀轉回提取瓶中繼續提取。最后將水提多糖溶液濃縮定容在50 mL容量瓶中。

2.3 苯酚-硫酸法測定總糖含量標準曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法[12],精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.171 1g,定容至100 mL容量瓶中,蒸餾水溶解并稀釋至刻度。得到1.711 g/L葡萄糖溶液。精密吸取1.711 g/L葡萄糖溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3 mL,分別置于50 mL容量瓶中,并用蒸餾水定容至刻度,即得系列葡萄糖標準溶液。分別精密吸取上述標準溶液各1 mL,置于10 mL比色管中,以1 mL蒸餾水為空白,每管加經重蒸的5%的苯酚1mL,加蓋并混勻。再分別加入5mL濃硫酸,加蓋,于漩渦振蕩器上徹底混勻1min,室溫靜置5min,沸水浴加熱 10 min,取出后冷水浴冷卻至室溫,于490 nm波長處測定吸光度,以吸光度A對應濃度C回歸。

2.4 樣品多糖含量的測定

分別精密吸取 0.25 mL正交實驗樣品,蒸餾水補齊1 mL,按“硫酸苯酚法測定總糖含量標準曲線的繪制”方法測定A值,并帶入回歸方程計算多糖濃度。則馬糞海膽生殖腺粗多糖得率計算公式為：

式中：T為馬糞海膽生殖腺粗多糖得率,m為樣品檢測時稀釋倍數,本實驗稀釋倍數為4,D為待測多糖樣品溶液體積,本實驗體積為50 mL,c為多糖濃度,M為馬糞海膽生殖腺質量。

3 結果與討論

3.1 正交實驗樣品多糖含量測定

(1)苯酚-硫酸法多糖回歸方程A=8.1723C-0.0567(R2=0.999 2),其中,A為吸光度,C為糖濃度。(2)線性范圍0.017 11～0.102 66 g/L。硫酸苯酚法測定總糖含量標準曲線見圖1。

圖1 硫酸苯酚法測定總糖含量標準曲線Fig.1 Calibration curve for glucose determination by the phenol sulfuric acid method

用上述標準曲線測定正交實驗所得樣品的多糖含量,結果見表2。根據表2的極差分析,可知,D因素(提取次數)的極差最大,C因素(料水比)次之,A因素(提取溫度)最小。所以影響馬糞海膽生殖腺粗多糖提取工藝的因素大小為：提取次數>料水比>提取時間>提取溫度,見圖2。

3.2 馬糞海膽生殖腺粗多糖的提取的最佳工藝

根據極差分析,得到馬糞海膽生殖腺粗多糖的提取的最佳工藝—A1B1C3D3,即 70℃水浴 1 h,料水比為1:20,共3次。按上述9組同樣操作,驗證最佳條件,共平行3組。得率平均值為1.66%。

表2 正交實驗分析結果Tab.2 Results of the orthogonal experiments

圖2 極差分析Fig.2 The analysis of the range

3.3 多元線性回歸模型(MLR)的建立

對正交實驗所取的 4 個自變量(Xi) 和確定的應變量(Y),采用 SPSS 統計軟件對上述相關參數進行逐步回歸,建立海膽多糖得率和提取參數之間的線性模型：

式中：T為提取溫度,t為提取時間,r為料水比,n為提取次數。所得到的模型的R=0.922,F=2.854,說明多糖得率和提取工藝有顯著的相關關系。

3.4 MLR模型的預測

為了檢驗建立的回歸模型的合理性,用正交試驗中的3號和8號進行預測,預測值及實驗值見表3。

表3 MLR模型的預測結果Tab.3 The predicted results of the MLR model

從表中可以看出MLR模型對于3號和8號實驗的預測結果較滿意,說明此模型具有很好的預測能力,可以應用于多糖得率的預測,為實驗提供了很好的理論依據。

4 結論

筆者認為,針對海洋生物多糖的提取類實驗,在一定范圍內,料水比、提取次數、提取時間與得率一般均正相關,所以采用正交實驗,用極差分析得到的最佳條件不一定是最大值,實驗也驗證了這個結論。但是通過正交實驗找到影響提取得率的因素的大小還是非常有必要的,它可以在指導生產的過程中降低成本。同時,采用正交實驗可以通過具有代表性的實驗建立線性模型,使得到的線性方程具有更廣泛的指導意義。

本實驗采用正交實驗研究馬糞海膽多糖的提取工藝,并首次用正交實驗多得到的結果建立了海膽多糖得率和提取參數之間的多元線性回歸模型,將所得到的模型用于海膽多糖得率的預測,結果令人滿意,說明此模型可以用于多糖得率的預測,所以該模型可以應用于生產實踐。

[1]Murata Y,Sata N U.Isolation and Structure of Pulcherrimine,a novel Bitter-Tasting amino acid,from the sea urchin (Hemicentrotus pulcherrimus) ovaries[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48:5 557-5 560.

[2]Yokota N,Sawada H.Experimental and field studies on foraging behavior and activity rhythm of hard-spined sea urchinAnthocidaris crassispina[J].Fisheries Science,2006,72: 796-803.

[3]Liu C H,Lin Q X,Gao Y,et al.Characterization and antitumor activity of a polysaccharide fromStrongylocentrotus nuduseggs[J].Carbohydrate Polymers,2007,67: 313-318.

[4]Yatsuya K,Nakahara H.Diet and stable isotope ratios of gut contents and gonad of the sea urchinAnthocidaris crassispina(A.Agassiz) in two different adjacent habitats,theSargassum areaandCorallina area[J].Fisheries Science,2004,70: 285-292.

[5]Agatsuma Y,Seki T.Instantaneous effect of dibromomethane on metamorphosis of larvae of the sea urchinsStrongylocentrotus nudusandStrongylocentrotus ermedius[J].Aquaculture,2006,251: 549-557.

[6]Biermann C H,Kessing B D.Phylogeny and development of marine model species:strongylocentrotid sea urchins[J].Evolution & Development,2003,5(4): 360-371.

[7]Lee Y H.Molecular phylogenies and divergence times of sea urchin species of strongylocentrotidae,echinoida[J].Molecular Biology and Evolution,2003,20(8): 1 211–1 221.

[8]張忠玲,朱波,張翠,等.海膽腸多糖致 Bel7402人肝癌細胞凋亡的掃描電鏡觀察[J].電子顯微學報,2003,22(6)：467-467.

[9]劉純慧,葉亮,林親雄,等.海膽黃多糖SEP的制備及其抗腫瘤作用研究[J].藥物生物技術,2006,13(6)：429-432.

[10]閻偉,宗世祥,駱有慶,等.逐步回歸模型在油蒿鉆蛀性害蟲預測中的應用[J].北京林業大學學報,2009,31：140-144.

[11]田昌林,鮑忠劍,田文儒,等.丙酮法和堿法脫脂對膠原蛋白生產的影響[J].動物醫學進展,2007,28(4)：43-47.

[12]李妍,魏建,許旭,等.苯酚-硫酸法定量測定桔梗多糖的研究[J].時珍國醫國藥,2009,20(1)：5-7.