紅球藻藻株對(duì)光強(qiáng)適應(yīng)及在工程培養(yǎng)中的應(yīng)用

韓春梅,劉建國(guó) ,張 勇

(1.大連工業(yè)大學(xué),遼寧大連 116034; 2.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所,山東青島 266071; 3.云南愛(ài)爾發(fā)生物技術(shù)有限公司,云南楚雄 675000)

蝦青素具有多種生物活性,尤其具有極高的抗氧化性,其還原能力是類胡蘿卜素的10倍、維生素E的100～550倍[1],在醫(yī)藥、保健、化妝品、食品以及飼料添加劑等方面都有廣泛的應(yīng)用前景[2]。雨生紅球藻能積累其干質(zhì)量1%以上的蝦青素,是目前已知蝦青素含量最高的生物來(lái)源,被認(rèn)為是天然蝦青素的濃縮品[3],其蝦青素構(gòu)型以 3S,3′S為主[4],與動(dòng)物體內(nèi)需求的蝦青素構(gòu)型基本一致,生物吸收效果較好。因此,培養(yǎng)紅球藻生產(chǎn)蝦青素是國(guó)際上藻類學(xué)當(dāng)前研究與開(kāi)發(fā)關(guān)注熱點(diǎn)。

雖然雨生紅球藻研究已日臻完善且已經(jīng)開(kāi)展規(guī)?；a(chǎn),但國(guó)外只有美國(guó)夏威夷 Aquasearch Inc.,Cyanotech Corporation Hawaii,Micro Gaia Inc.Hawaii和瑞典AstaCarotene AB等少數(shù)公司從事紅球藻天然蝦青素批量生產(chǎn),遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)對(duì)天然蝦青素需求。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室研究相對(duì)成熟,規(guī)?；a(chǎn)正在起步。眾所周知,室內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究與實(shí)際生產(chǎn)存在很大差異,前者多側(cè)重闡述科學(xué)技術(shù)問(wèn)題,實(shí)驗(yàn)規(guī)模很小,培養(yǎng)條件比較容易控制,產(chǎn)業(yè)化規(guī)模通常較大,光照和溫度等關(guān)鍵培養(yǎng)條件難于經(jīng)濟(jì)而有效地控制,故需要因地制宜篩選適宜于當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境變化的藻株。作者結(jié)合云南愛(ài)爾發(fā)公司具體情況,選取3株分別原產(chǎn)中國(guó)、瑞典和挪威的紅球藻,針對(duì)云南楚雄地區(qū)光溫季節(jié)性變化開(kāi)展了相關(guān)研究,目的提供篩選適宜于規(guī)?；a(chǎn)的紅球藻藻株的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),促進(jìn)該產(chǎn)業(yè)在中國(guó)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種和培養(yǎng)基

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)藻株共 3株,分別編號(hào)為H0、H2、H3,全部來(lái)自中國(guó)科學(xué)院海洋研究所藻類與藻類生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

培養(yǎng)基為MCM的修正配方[5]。

1.2 培養(yǎng)條件方法

將雨生紅球藻接種到5 L的三角燒瓶中,在溫室車間通氣培養(yǎng),按照2.50 L/min氣量通入0.55% CO2加富空氣,補(bǔ)充 CO2消耗和攪拌藻液,以自然漫散光為光源,光照時(shí)間隨季節(jié)變化,光照強(qiáng)度隨入射光線角度不同而出現(xiàn)變化,光強(qiáng)相當(dāng)于直射光能的30%～55%。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地位于北緯25.0°、東經(jīng)101.5°,海拔1 900 m,根據(jù)楚雄當(dāng)?shù)貧庀蟛块T統(tǒng)計(jì)其主要?dú)夂蛸Y料如表1所示,年均氣溫為15 ℃±2 ℃。

表1 實(shí)驗(yàn)地區(qū)云南楚雄的基礎(chǔ)氣象資料(30年平均)Tab.1 The meteorologic data of Chuxiong,Yunnan during 1971~2000

1.3 細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞大小和比生長(zhǎng)速率的計(jì)算

在培養(yǎng)期間定時(shí)取樣,用血球計(jì)數(shù)板顯微計(jì)數(shù)。每一處理至少 2 個(gè)樣本,每個(gè)樣本重復(fù)顯微計(jì)數(shù)20 次,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。細(xì)胞大小利用測(cè)微尺測(cè)定,每個(gè)樣本測(cè)定20次,取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

其中,μ為比生長(zhǎng)速率,N2是時(shí)間T2時(shí)的細(xì)胞密度,N1是時(shí)間T1時(shí)的細(xì)胞密度。

1.4 葉綠素和蝦青素含量的測(cè)定

取一定體積藻液于離心管中,離心后棄上清液,藻渣中加入100%的丙酮研磨。再次離心,將上層色素溶液轉(zhuǎn)移到容量瓶中,藻渣按上述方法重新萃取,直到藻體成白色為止,色素溶液匯合并定容。采用722S 型分光光度計(jì)和 1 cm 光徑的比色杯,分別測(cè)定 480、645、663 nm 波長(zhǎng)下色素提取液的光吸收值(A值)。依據(jù) Lichtenthaler[6]和 Davies[7]的方法計(jì)算蝦青素質(zhì)量濃度,公式如下：

1.5 葉綠素連續(xù)熒光動(dòng)力學(xué)測(cè)定

細(xì)胞生長(zhǎng)主要發(fā)生在游動(dòng)細(xì)胞階段,而蝦青素積累是在不動(dòng)細(xì)胞階段進(jìn)行的,細(xì)胞轉(zhuǎn)化是游動(dòng)細(xì)胞向不動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和蝦青素累積的關(guān)鍵轉(zhuǎn)變點(diǎn),觀察不同類型藻株在細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中的光化學(xué)特性與光能分配差異,可以很好地解釋為什么不同藻株對(duì)不同環(huán)境條件變化的適應(yīng)存在差異。為此,選擇綠色游動(dòng)細(xì)胞、剛進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化還未積累蝦青素的綠色不動(dòng)細(xì)胞、以及已經(jīng)積累蝦青素的紅色不動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

分別取不同株系不同發(fā)育階段(綠色游動(dòng)細(xì)胞、綠色不動(dòng)細(xì)胞和紅色不動(dòng)細(xì)胞)紅球藻藻液 2 mL于測(cè)量瓶中,以滅菌培養(yǎng)液為對(duì)照,黑布遮光黑暗適應(yīng)15 min。然后利用英國(guó)Hansatech公司Handy Pea便攜式植物效率分析儀,以650 nm波長(zhǎng)紅光為光源,按照預(yù)先設(shè)計(jì)的程序測(cè)定活藻體連續(xù)激發(fā)熒光的動(dòng)力學(xué)曲線,共測(cè)定 16個(gè)光照點(diǎn),每點(diǎn)光照持續(xù)時(shí)間2 s,閃爍光強(qiáng)梯度依次為10、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500、750、1000、1500、2000 μmol /(m2·s),每點(diǎn)光照之間黑暗10 s,每株紅球藻樣品處理重復(fù) 3次,記錄從微秒-毫秒到秒級(jí)熒光強(qiáng)度變化,得到OJIP曲線[8,9]。

依Biolyzer軟件對(duì)OJIP曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)分析獲得紅球藻株系的相關(guān)光合反應(yīng)參數(shù)。其中：Fm為所有反應(yīng)中心完全關(guān)閉時(shí)的熒光,即暗適應(yīng)后最大熒光強(qiáng)度; PSⅡ最大光化學(xué)效率代表可變熒光強(qiáng)度與最大熒光強(qiáng)度的比率;Vj反映了照光2 ms時(shí)有活性的反應(yīng)中心PSⅡ的關(guān)閉程度;Vi代表照光30 ms時(shí)有活性的反應(yīng)中心 PSⅡ的關(guān)閉程度;T＝0時(shí),電子傳遞量子產(chǎn)額以ET0/ABS表示; ABS/RC代表單位反應(yīng)中心PSⅡ吸收的光能; TR0/RC代表T0時(shí)單位反應(yīng)中心PSⅡ捕獲的用于還原QA的能量; ET0/RC為T0時(shí)單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量; DIo/RC指在T0時(shí)單位反應(yīng)中心耗散掉的能量; DI/ABS為熱耗散能量占吸收能量的比率; PI(abs)為T0時(shí)以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)[10]。

表2 不同雨生紅球藻藻株細(xì)胞生長(zhǎng)的年際變化Tab.2 Year-round changes in cell growth of different strains of H.pluvialis

2 結(jié)果與討論

2.1 藻株生長(zhǎng)速率的年際變化

對(duì)比不同藻株培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞大小、細(xì)胞數(shù)目、葉綠素含量和吸光度等一系列生長(zhǎng)指標(biāo)(表 2),從中可以看出,在旺盛生長(zhǎng)的游動(dòng)細(xì)胞階段不同藻株之間大小變化沒(méi)有明顯規(guī)律,細(xì)胞直徑一般在 24 μm左右,隨季節(jié)交替出現(xiàn)一定幅度波動(dòng),在大多數(shù)時(shí)間(5～11月份共7個(gè)月)內(nèi),H3細(xì)胞直徑相對(duì)而言略大些,但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差別不很明顯,這可能與該藻細(xì)胞分裂速度相對(duì)較慢有一定關(guān)系。

其他不同指標(biāo)顯示生長(zhǎng)方面雖然也存在一定差異,但總體上相互之間呈現(xiàn)很好的正相關(guān)性。為更簡(jiǎn)單明確地比較藻株生長(zhǎng)速率的年際變化規(guī)律,僅選取細(xì)胞數(shù)目指標(biāo)進(jìn)行分析。表 2結(jié)果表明,不僅不同藻株生長(zhǎng)速率變化很大,而且同一藻株年際變化也很大。其中比生長(zhǎng)速率最快時(shí)超過(guò) 0.6,即每周生物量?jī)粼黾?6倍; 而比生長(zhǎng)速率最慢時(shí)不足0.12,每周生物量只增加 1倍多。生長(zhǎng)速率最高的藻株在不同的月份中出現(xiàn)的頻率不一樣,其中藻株 H0相對(duì)生長(zhǎng)較快的時(shí)間出現(xiàn)較多,在 1～5月、9月、11～12月份共8個(gè)月中藻株H0生長(zhǎng)速率都是最高的; 在其余的6～8月和10月份共4個(gè)月中,生長(zhǎng)較快的藻株為H2; 而藻株H3生長(zhǎng)速度在任何時(shí)間段都沒(méi)有表現(xiàn)出比其他2株紅球藻快。

因此,在生產(chǎn)上春、秋季和冬季選用藻株 H0預(yù)期可獲得最大生物量,而在上述季節(jié)中(除4～5月外),無(wú)論光照還是溫度在全年中都相對(duì)偏弱(表 1),比較適宜于該藻株生長(zhǎng)。而在夏季選用藻株H2可獲得更多的紅球藻生物量,夏季雖然屬于多雨季節(jié)但光照和溫度是全年最高的時(shí)期,H2藻株相對(duì)而言更適宜在較高溫度和光照條件下生長(zhǎng)。

進(jìn)一步對(duì)比溫度和光照資料(表 1),不難發(fā)現(xiàn)從4月到9月份,氣溫較高而日照時(shí)間長(zhǎng)(降水天數(shù)少),為什么4～5月藻株H0生長(zhǎng)較快,而6～8月份藻株H2生長(zhǎng)較快？進(jìn)一步分析降雨資料就可以看出,4～5月份陰天日數(shù)和降雨量相對(duì)都偏少,因此推測(cè) 4～5月份的光、溫?cái)?shù)據(jù)值應(yīng)該相對(duì)穩(wěn)定,不存在反復(fù)無(wú)常的巨大變化; 相反在 6～8月份陰天日數(shù)和降雨量都偏多,也就意味著光、溫?cái)?shù)據(jù)值隨天氣變化時(shí)常呈現(xiàn)很大幅度變動(dòng),在晴天時(shí)極端高溫應(yīng)更高、光線更強(qiáng),相反在陰雨天溫度相應(yīng)較低。從這點(diǎn)講 H2藻株比H0對(duì)不斷變化的高溫和高光強(qiáng)適應(yīng)能力更強(qiáng)。

2.2 不同藻株累積蝦青素的年際變化

雨生紅球藻累積蝦青素的年際變化(圖1)結(jié)果表明,3株紅球藻都是能累積蝦青素的藻株,盡管不同月份季節(jié)藻株間蝦青素含量存在一定差別,但其變化趨勢(shì)卻存在普遍性的共同增加或減少。對(duì)比不同月份各藻株蝦青素含量可以發(fā)現(xiàn),藻株 H0蝦青素含量出現(xiàn)較高的頻率最多(全年中有7個(gè)月),其次為H2藻株,其蝦青素含量最高有 3個(gè)月,而藻株 H3蝦青素含量最高的月份比較少(全年只有2個(gè)月)。

在藻株H0積累蝦青素含量最高的1～2月、4月、9月、11～12月,也是藻株H0相對(duì)生長(zhǎng)較快的時(shí)期(表2),在藻株H2蝦青素積累量最高的7～8月和10月份,也是該藻細(xì)胞生長(zhǎng)較快的季節(jié)(表 2),即細(xì)胞生長(zhǎng)速率與蝦青素含量呈正相關(guān),該吻合表明藻株細(xì)胞生長(zhǎng)速率快慢主要決定著紅球藻生產(chǎn)蝦青素多少。而在 3月、5月,藻株 H3蝦青素含量最高但其細(xì)胞生長(zhǎng)速率并不快,表明此期該株藻單位細(xì)胞內(nèi)累積的蝦青素量最高。故可以認(rèn)為藻細(xì)胞累積蝦青素能力是決定產(chǎn)量的另一關(guān)鍵因素,其重要性僅次于細(xì)胞生長(zhǎng)速率。

圖1 不同藻株蝦青素質(zhì)量濃度的年際變化Fig.1 Year-round changes of astaxanthin contents in 3 trains of H.pluvialis

2.3 藻株間及藻株不同發(fā)育階段對(duì)光適應(yīng)的差異

不同藻株在不同發(fā)育階段對(duì)光的需求結(jié)果(表3)表明,紅球藻各藻株之間以及不同發(fā)育階段光合作用對(duì)光的需求量存在一定差異。其中,在游動(dòng)階段(特別是 H2)的綠色游動(dòng)細(xì)胞光合作用對(duì)光需求普遍較高,H0、H2和H3光飽和點(diǎn)分別為750、1000、750 μmol /(m2·s); 不動(dòng)細(xì)胞階段綠色細(xì)胞時(shí)期,不同藻株光合作用對(duì)光需求減小,該階段藻株H0、H2和H3綠色不動(dòng)細(xì)胞的光飽和點(diǎn)分別為750、750、500 μmol/(m2·s); 而不動(dòng)細(xì)胞階段的紅色細(xì)胞 H0、H2和 H3對(duì)光需求相對(duì)最弱,其藻株的光飽和點(diǎn)分別為500、750、500 μmol /(m2·s)。因此,不同藻株光合作用對(duì)光的需求順序是 H2＞H0＞H3,同一藻株不同發(fā)育階段光合作用對(duì)光需求的順序：綠色游動(dòng)細(xì)胞＞綠色不動(dòng)細(xì)胞＞紅色不動(dòng)細(xì)胞。

表3 實(shí)驗(yàn)藻株不同發(fā)育階段的光飽和范圍Tab.3 Light saturation points for cells at different development stages in 3 strains of H.pluvialis

對(duì)比表1和3數(shù)據(jù),不同藻株對(duì)光的需求與實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)果是一致的,藻株 H2光合作用可以在更高的光強(qiáng)下進(jìn)行,因此相對(duì)而言在光線較強(qiáng)(或因云層不斷變換導(dǎo)致光照強(qiáng)度瞬間出現(xiàn)大幅度變化)、以及多陰雨的夏季生長(zhǎng)較好(表2)。對(duì)藻株H0而言,光合作用需求光照相對(duì)適中,在全年大多數(shù)季節(jié)(春、秋和冬季)生長(zhǎng)相對(duì)較快(表 2)。而藻株H3,由于光合作用對(duì)光需求比較弱,不適宜在自然強(qiáng)光下生長(zhǎng),生長(zhǎng)速率在全年之中很少表現(xiàn)較快(表2),相反,過(guò)多的光能勢(shì)必產(chǎn)生系列危害(如強(qiáng)光下大量產(chǎn)生過(guò)量活性氧自由基和誘發(fā)膜脂過(guò)氧化發(fā)生等),為此藻株 H3細(xì)胞采取積累大量蝦青素的策略,消耗過(guò)剩光能、淬滅活性氧自由基,屏蔽性吸收光線保護(hù)細(xì)胞器,這可解釋為什么藻株 H3在某些月份(3月、5月)細(xì)胞生長(zhǎng)速率雖不快,但產(chǎn)生的蝦青素卻最多(圖 1)。

2.4 紅球藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中的光化學(xué)特性與光能分配

紅球藻(以 H0為例)不同發(fā)育階段的連續(xù)熒光動(dòng)力學(xué) OJIP曲線如圖 2所示,從中可以看出,紅色不動(dòng)細(xì)胞的暗適應(yīng)后最大熒光強(qiáng)度Fm最高(圖2A-3),而綠色游動(dòng)細(xì)胞的Fm最低(圖 2A-1),綠色不動(dòng)細(xì)胞的Fm介于二者之間(圖2A-2)。因此,綠色游動(dòng)細(xì)胞最大光化學(xué)效率＜綠色不動(dòng)細(xì)胞＜紅色不動(dòng)細(xì)胞,依次分別為0.666,0.716和0.768。從圖2B中還可以看出,相對(duì)于游動(dòng)細(xì)胞而言,不動(dòng)細(xì)胞特別是綠色不動(dòng)細(xì)胞熒光曲線在2 ms時(shí)出現(xiàn)明顯上升(圖2B-2和圖2B-3),同樣在照光30 ms時(shí)綠色不動(dòng)細(xì)胞曲線(圖2B-2)也存在明顯變化,上述熒光強(qiáng)度Vj或Vi差異均表明在紅球藻從游動(dòng)細(xì)胞向不動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中,其有活性反應(yīng)中心 PSⅡ的關(guān)閉程度發(fā)生了很大變化。綠色游動(dòng)細(xì)胞最大熒光出現(xiàn)的時(shí)間比不同細(xì)胞早,隨后在500 ms處呈現(xiàn)快速下降(圖2B),意味著在游動(dòng)細(xì)胞中,捕獲能量經(jīng)反應(yīng)中心 PSⅡ轉(zhuǎn)化并進(jìn)入電子傳遞鏈后的流通過(guò)程是非常順暢的。

圖2 藻株 H0不同發(fā)育階段細(xì)胞的連續(xù)熒光動(dòng)力學(xué) OJIP曲線Fig.2 The continuous fluorescence kinetic OJIP curves of different cells of H.pluvialis strain Ho

依 Biolyzer軟件對(duì)圖 2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析獲得光化學(xué)反應(yīng)參數(shù)和能量分配模式(圖 3)。To時(shí),單位反應(yīng)中心 PSⅡ吸收的光能(ABS/RC)在不同類型紅球藻細(xì)胞中存在差異,即以綠色游動(dòng)細(xì)胞最多(圖 3-1A),綠色不動(dòng)細(xì)胞次之(圖 3-2A),而紅色不動(dòng)細(xì)胞最少(圖3-3A)。就單位反應(yīng)中心PSⅡ捕獲的用于還原QA的能量TR0/RC而言,在不同類型紅球藻中的趨勢(shì)同ABS/RC基本一致,差別相對(duì)不明顯(圖 3-1A,3-2A,3-3A),在反應(yīng)中心以熱量形式耗散能量(DI0/RC)中綠色游動(dòng)細(xì)胞＞綠色不動(dòng)細(xì)胞＞紅色不動(dòng)細(xì)胞。被反應(yīng)中心捕獲然后用于電子傳遞能量參數(shù)也是綠色游動(dòng)細(xì)胞＞綠色不動(dòng)細(xì)胞＞紅色不動(dòng)細(xì)胞。該結(jié)果可進(jìn)一步說(shuō)明表 2綠色細(xì)胞光合作用需要更多的光線,而紅色不同細(xì)胞光合作用對(duì)光線需求最低。

圖3 藻株H0不同發(fā)育階段細(xì)胞光化學(xué)反應(yīng)參數(shù)和能量分配模式Fig.3 The photochemical parameters and their energy pipeline models of H.pluvialis strain H0 at different developmental stages

圖3結(jié)果還表明,不同類型細(xì)胞在單位面積被反應(yīng)中心 PSⅡ捕獲能量(TR/ABS)存在一定差異(圖3-1B,3-2B,3-3B),最大光化學(xué)效率從綠色游動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化到綠色不動(dòng)細(xì)胞,然后累積蝦青素的紅色不動(dòng)細(xì)胞依次上升,分別為0.666,0.716和0.768。上述不同類型細(xì)胞的最大光化學(xué)效率并不存在巨大的差異,但是由于綠色游動(dòng)細(xì)胞中有活性的反應(yīng)中心PSⅡ很少,僅是紅色不動(dòng)細(xì)胞的19%(圖3-1B,3-3B),大部分(約 91%)反應(yīng)中心 PSⅡ失活; 在綠色不動(dòng)細(xì)胞中也只有90%反應(yīng)中心PSⅡ存在活性(圖3-2B)。因此To時(shí)單位面積捕獲的光能用 TR0/CS0和用于電子傳遞的能量(ET0/CS0)在綠色游動(dòng)細(xì)胞中都非常少(圖3-1C)。同樣,相對(duì)于不動(dòng)細(xì)胞而言,Tm時(shí)綠色游動(dòng)細(xì)胞單位面積捕獲的光能(TR0/CSm)和用于電子傳遞的能量(ET0/CSm)也都非常少(圖3-1D)。

從光能以熱量消耗角度分析,無(wú)論單位光合中心 PSⅡ耗散的熱能(DI0/RC)還是散失熱能占吸收光能的比率(DI0/ABS),都是綠色游動(dòng)細(xì)胞＞綠色不動(dòng)細(xì)胞＞紅色不動(dòng)細(xì)胞(圖3-A和3-B)。但是,當(dāng)光能被光合中心 PSⅡ捕獲和轉(zhuǎn)化進(jìn)入電子傳遞以后,綠色細(xì)胞單位面積以熱輻射形式散失的能量都小于不動(dòng)細(xì)胞(圖3-C和3-D)。上述結(jié)果說(shuō)明,綠色游動(dòng)細(xì)胞過(guò)多熱量耗散發(fā)生在光量子到達(dá)光合反應(yīng)中心 PSⅡ之前。

雨生紅球藻是一種單細(xì)胞淡水綠藻,在雨生紅球藻生長(zhǎng)的過(guò)程中,如果遇到脅迫條件,如高光強(qiáng)、高溫、營(yíng)養(yǎng)鹽(氮、磷)饑餓、鹽脅迫等,綠色游動(dòng)細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)化為不動(dòng)細(xì)胞并積累大量蝦青素而變紅。這種形態(tài)轉(zhuǎn)變并伴隨有蝦青素積累有其重要生理生態(tài)意義,作者認(rèn)為可從以下角度分析：

其一,按照 McCord和 Fridovich[11]提出的自由基傷害學(xué)說(shuō),在脅迫條件下,植物體內(nèi)的自由基和產(chǎn)生自由基的物質(zhì)含量增加,導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)之間的平衡被破壞。在大規(guī)模利用自然光培養(yǎng)過(guò)程中,日光強(qiáng)度通常達(dá)到2000 μmol /(m2·s)以上(在云南楚雄直射光強(qiáng)度一般在 2000～3000 μmol/(m2·s)超過(guò)細(xì)胞光和作用需要的光照強(qiáng)度數(shù)倍(表3),即使光線在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中被屏蔽掉30%～55%相對(duì)于光合需求而言仍然過(guò)高,因此過(guò)多的光線不可避免地導(dǎo)致植物體內(nèi)大量積累活性氧自由基。過(guò)量的自由基與質(zhì)膜和生物大分子反應(yīng),導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化,蛋白質(zhì)降解,DNA突變和鏈的斷裂以及蛋白質(zhì)的損傷[12],從而對(duì)生物體造成傷害。Liu等[13]利用甲基紫精(MV)誘導(dǎo)產(chǎn)生 O2—,通過(guò)測(cè)定抗氧化酶系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ASA-POD),以及分析丙二醛(MDA)含量變化窺測(cè)膜脂過(guò)氧化程度,比較了不同類型雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)和蝦青素的抗氧化能力。確定雨生紅球藻有兩種抗氧化機(jī)制,一種是綠色游動(dòng)細(xì)胞中的抗氧化酶,另一種是紅色細(xì)胞中的抗氧劑蝦青素。在其生活周期中,隨著細(xì)胞轉(zhuǎn)化由一種防御系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N防御系統(tǒng)來(lái)抵御環(huán)境氧化脅迫。綠色游動(dòng)細(xì)胞主要依靠保護(hù)酶系統(tǒng)來(lái)清除活性氧,而不動(dòng)細(xì)胞主要依靠蝦青素發(fā)揮作用。蝦青素的抗氧化作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)保護(hù)酶系統(tǒng)[13]。

其二,紅球藻蝦青素積累通常發(fā)生在脅迫條件下,這時(shí)產(chǎn)生過(guò)多的能量以蝦青素形式儲(chǔ)存起來(lái),以備后用,而不是以熱形式釋放造成局部溫度過(guò)高,看來(lái)也是細(xì)胞一種非常經(jīng)濟(jì)有效的適應(yīng)策略。該結(jié)果從能量模型中分配給光合能量中可獲得印證,紅球藻不動(dòng)細(xì)胞所捕獲和用于電子傳遞的能量以及最大光化學(xué)效率都比游動(dòng)細(xì)胞高(圖3)。

另外,作者認(rèn)為蝦青素累積在脂質(zhì)小體中,包圍在細(xì)胞核周圍和葉綠體類囊體片層等重要細(xì)胞器外面,形成屏障過(guò)濾光線,可降低強(qiáng)光以及紫外線等對(duì)上述細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生殺傷作用[14]。如果如此,紅色不動(dòng)細(xì)胞散失熱能占吸收光能比率(DI0/ABS)和單位光合中心 PSⅡ耗散的熱能(DI0/RC)應(yīng)最大。事實(shí)相反,DI0/ABS 和DI0/RC大小順序?yàn)榫G色游動(dòng)細(xì)胞＞綠色不動(dòng)細(xì)胞＞紅色不動(dòng)細(xì)胞(圖 3-A和圖 3-B),本結(jié)果看似沒(méi)有支持本假說(shuō),但進(jìn)一步考慮到葉綠素?zé)晒夥治鍪褂玫墓庠礊閱紊?波長(zhǎng)在 660 nm,蝦青素在此波長(zhǎng)下并沒(méi)有任何吸收,因此目前還不能否定該假設(shè),如果換以波長(zhǎng)更短的紫色或藍(lán)色光進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果就可能支持本假設(shè)。

3 結(jié)論

(1) 雨生紅球藻在不同發(fā)育階段光合作用對(duì)光需求最大的為綠色游動(dòng)細(xì)胞階段,其次為綠色不動(dòng)細(xì)胞,對(duì)光需求最小的為紅色不動(dòng)細(xì)胞,且不同藻株間光合作用對(duì)光需求存在差異性,其中H2＞H0＞H3。

(2) 在云南地區(qū)規(guī)?；a(chǎn)中,建議秋末、冬、春和夏初季節(jié)選擇藻株 H0,而在夏季和秋初選用藻株 H2培養(yǎng)可獲得蝦青素含量更高的雨生紅球藻藻粉。

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