雞傳染性法氏囊病病毒秦皇島株的分離鑒定*

魯改儒,張艷英,孟立根

(1.河北農業大學中獸醫學院,河北定州073000;2.河北師范科技學院,河北秦皇島066000)

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)于1957年首次在美國特拉華州南部的甘布羅(Gumboro)地區發現(又稱甘布羅病)[1]。該病現己呈全球性流行,據調查美國雞群的血清陽性率近100%,南美為90%,荷蘭為88%,意大利為76%,日本約為75%,德國為61.50%[2]。目前IBD在我國已傳遍各地,某些地方發病率高達80%以上,病死率在30%～70%或以上[3]。IBDV主要侵害4周齡～6周齡的雛雞,破壞雞的體液免疫器官——法氏囊,它主要破壞法氏囊中正在分化成熟的B淋巴細胞,引起雞的急性發病甚至死亡,亞臨床感染雞和康復雞可產生免疫抑制和生長抑制[4-5],增加了對新城疫、馬立克病和傳染性支氣管炎等的敏感性[6]。1987年,一種以高發病率和高病死率為特征的IBDV超強度(vvIBDV)或高致病力IBDV(hvIBDV)毒株陸續在荷蘭、英國、比利時、德國、日本等國家報道,辛桂香等報道我國也存在著這種vvIBDV[7]。多數學者認為vvIBDV是引起雞IBD免疫失敗的主要因素。近年來由于變異株和超強毒株的不斷出現,免疫失敗時有發生,給IBD的防控帶來了極大的困難[8-10]。IBDV感染火雞、鴨、雛鵝、鴕鳥、灰天鵝、雉雞等的病例也相繼有報道,因此本病己成為危害世界養禽業最嚴重的傳染病之一。

近年來,IBD流行出現了一些新的特點:病死率比過去增高,過去一般在10%以下,現在一般為13%～50%,超強毒株病死率高者可達94%[11];IBD流行多在使用本病弱毒疫苗4 d～7 d后發病;IBD的流行不僅抑制或降低了雛雞對多種疫苗(尤其是新城疫疫苗)的免疫應答,而且提高了雞對某些微生物的易感性[12]。

本病主要是通過發病情況、臨床癥狀、病理剖檢進行臨床診斷,對流免疫電泳和PCR技術等實驗室方法可鑒定毒株的類型,以指導臨床正確選擇疫苗,進行科學的免疫預防和有效控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 秦皇島某養雞場送檢的4周齡蛋雞8只。

1.1.2 試劑 1 000 IU/mL青鏈霉素,雞傳染性法氏囊病標準抗原(效價1∶64)(哈爾濱獸醫研究所),標準陽性血清(效價1∶128)(哈爾濱獸醫研究所),PBS緩沖液,巴比妥緩沖液(pH 8.6、離子強度0.05m ol/L),15 g/L瓊脂糖、蛋白酶K(北京欣源佳和生物有限公司),100 g/L十二烷基硫酸鈉(SDS),飽和酚(批號20081214),氯仿∶異戊醇(24∶1),TE緩沖液(pH 8.0),70%乙醇(天津市凱通化學試劑有限公司,批號20090215),無水乙醇(天津市凱通化學試劑有限公司,批號20081205),RT buffer(反應緩沖液),DTT(二硫蘇糖醇,上海前塵生物科技有限公司),dNTP(三磷酸脫氧核糖核苷,上海前塵生物科技有限公司),ddH2O(去離子水),反轉錄酶M-M uLv(MBI公司),RNA sin(RNA酶抑制劑,華美生物工程公司),Taq DNA聚合酶(寶生物工程(大連)有限公司),瓊脂糖(上海Yito企業有限公司)。

1.1.3 實驗動物 SPF雞購于梅里亞維通實驗動物中心。易感雞購自秦皇島市徳寬種雞孵化場。

1.2 方法

1.2.1 擴增VP2高變區的引物設計方案 P1:5′-TCACCGTCCTCAGCTTAC-3′,對應于ORFA-1第495位到512位核苷酸,長18 bp;P2:5′-TCAGGATTTGGGATCAGC-3′,互補于ORFA-1第1 120位到1 137位核苷酸,長18 bp;P3:5′-GCCCAGAGTCTACACCATAACTGC-3′,對應于ORFA-1第607位到630位核苷酸,長24 bp;P4:5′-GCGACCGTAACGACAGATCC-3′,互補于ORFA-1第1 081位到1 100位核苷酸,長20 bp;以P3、P4為引物,所得擴增產物應為494 bp。由張艷英老師提供。

1.2.2 病毒分離與篩選

1.2.2.1 病料處理 采集病變典型的法氏囊,以1∶3加入滅菌的PBS緩沖液,勻漿機制成乳劑,經反復凍融3次后以3 000 r/min離心10m in,取上清液備用。

1.2.2.2 病毒篩選分離 用10 g/L瓊脂糖凝膠對流免疫電泳(CIE)試驗,對1.2.1.1中制備的囊上清液進行篩選分離。將勻漿上清液依次判定結果。

將對流免疫電泳試驗陽性的法氏囊上清液,加入1 000單位/mL青、鏈霉素作用2 h～4 h后,滴鼻、點眼接種4周齡SPF雞0.2mL/只,接種后72 h取出感染雞法氏囊,制備上清液(方法同1.2.2.1)。

1.2.3 病毒鑒定

1.2.3.1 套式RT-PCR擴增與氨基酸序列分析

病毒RNA提取。移取1.2.2.1中制備的囊勻漿上清0.5 mL,加入蛋白酶K至終濃度100μg/mL,100 g/L SDS至終濃度5 g/L,50℃消化1 h～2 h。等體積酚(水飽和),氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提1次,上層水相用2.5倍無水乙醇沉淀。沉淀用700mL/L乙醇洗2次,空氣干燥后重懸于20μL pH 8.0TE緩沖液。

反轉錄(RT)。5×反應緩沖液4μL,DTT 2μL,P1 0.5μL(25 pmol),dNTP(10 mmol/L)1μL,病毒RNA 1μL,ddH2O 10μL。混勻,沸水中煮10 min,立即置冰浴冷卻至室溫,加入M-MuLV(200 U/μL,寶靈曼公司)0.5μL,RNasin(華美公司)1μL。混勻,瞬時離心,42℃保溫1 h。95℃5min滅活反轉錄酶。

PCR擴增與鑒定。10×PCR緩沖液5μL,dNTP(10 mm ol/L)1μL,P1 1μL(50 pmol),P2 1μL(50 pm ol),RT產物5μL,ddH 2 O 36.5μL,Taq酶(5 U/μL)0.5μL(中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室提供)。混勻,進入PCR循環:94℃30 s;94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,30個循環;72℃延伸10 min。取10μL反應產物,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

套式PCR(nested-PCR)擴增與鑒定。以上述RT-PCR擴增的產物為模板,在內部引物P3、P4引導下,對目的產物進行進一步的擴增,反應條件如下:10×PCR緩沖液5μL,dNTP(10mmol/L each)1μL,P3 1μL(50pmo l),P4 1μL(50 pmol),上述PCR產物0.5μL,ddH2O 41.0μL,Taq酶0.5μL(5 U/μL)。混勻,進入PCR循環:94℃30 s;94℃30 s,60℃30 s,72℃30 s,30個循環;72℃延伸10 min。取10μL反應產物,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

氨基酸序列分析。將Nested-PCR擴增產物進行測序。根據測定的IBDV VP2高變區cDNA序列,采用GENEman和DNA Star計算機系統推導編碼蛋白質的氨基酸序列,并進行分析比較。

1.2.3.2 回歸試驗 取上述法氏囊上清液,經滴鼻和口服途徑感染21日齡～25日齡健康易感雞8只,對照雞4只,接種0.5mL/只,在感染后48 h～72 h剖檢觀察并記錄。

2 結果

2.1 對流免疫電泳法

被檢抗原(1.2.2.1中制備的囊上清液)8羽份,抗原孔與抗體孔均出現明顯沉淀線。結果為陽性。

2.2 套式RT-PCR擴增與氨基酸序列分析

經套式PCR再次擴增后,取5μL反應產物電泳檢測。在約490 bp大小處,被檢毒株均可見一條與預期的產物大小相符的條帶,而且陰性對照和空白對照均沒有條帶出現,符合預期結果(圖1)。

根據高變區內氨基酸同源性,用平均距離法和聚類程序PXD,作出秦皇島毒株與已發表的國際標準強毒株的親緣關系樹狀圖譜(圖2)。從樹狀圖上比較容易發現,HeB-qhd與超強毒株OKYM,UK 661,DV 86最相近同源性高達100%,具有強毒特征的毒株HeB-qhd與V 3、V 2親緣關系較近(97.9%～99.3%)。對收集的毒株進行了VP2高變區序列分析,和有關文獻報道的超強毒株進行了對照,發現H eB-qhd毒株具備了超強毒的3個典型的特征:①249位和254位的氨基酸分別為Q和G,而非K和S,從而保證其抗原性不發生變異;②七肽區保守SWSASGS不變,且279位和284位氨基酸分別為D和A,而非N和T;③222、294、299位具有3個特征性氨基酸,分別為A、I和S,這3個氨基酸使得超強毒株的親和性發生變化,從而導致毒力大大增強。通過比較分析待檢毒株為超強毒株。

圖1 VP2高變區的反轉錄PCR/套式PCR擴增產物Fig.1 VP2 hypervariab le region of RT-PCR/nest RT-PCR

圖2 秦皇島IBDV毒株與已發表的國際標準強毒株的氨基酸序列樹狀圖Fig.2 The am ino acid sequen ce tree of Qinhuangdao IBDV strains and the in ternational standard virulent strains

本試驗所測秦皇島毒株其主要的氨基酸變化同幾個國際上標準強毒株的VP2高變區推測的氨基酸序列見表1。

表1 秦皇島IBDV分離株與參考毒株在VP2高變區的特征性氨基酸Table 2 The characteristic amino acids of Qinhuangdao IBDV isolate and reference strains in the VP2 hypervariable region

2.3 回歸試驗

人工接種21日齡～25日齡易感雞36 h開始發病,8只試驗易感雞全部發病,4只對照雞不發病,發病雞排出灰白色稀糞,羽毛蓬松、戰栗。剖檢可見,法氏囊黏膜嚴重出血,呈“紫葡萄”樣外觀,剖開可見出血或有淡黃色的膠凍樣滲出液。腿部、胸部肌肉有嚴重出血,腺胃與肌胃交界處出現嚴重的帶狀出血。

3 討論

近年來,IBD的流行出現了新的特點,其臨床癥狀及病變不典型,免疫失敗現象較為常見,超強毒(vvIBDV)成為主要流行毒株。因此,對本病的早期確診就顯得尤為重要。目前用于檢測IBDV的方法有瓊脂擴散試驗(AGP)、對流免疫電泳(CIE)、間接血凝試驗、ELISA、中和試驗和PCR技術等,但由于試驗條件和試驗成本等因素限制,只有免疫擴散法真正得到推廣應用。瓊脂擴散法雖然簡便易行,但其敏感性和特異性都不高,而且必須在試驗后24 h～48 h才能觀察結果。

對流免疫電泳(CIE)是將雙向免疫擴散與電泳相結合的一種技術。用CIE試驗,抗原和抗體分別受電泳力和電滲力的作用呈定向相對泳動,既加速了反應的出現,也限制了抗原和抗體向四周自由擴散的傾向,因而提高了敏感性。用CIE方法只需30 min～60 min就出結果,而且特異性高,重復性好,檢測效果明顯好于瓊擴法。

PCR技術作為RNA病毒的一種特異診斷方法,具有快速、特異、靈敏等特點。RNA酶在環境中無處不在,為防止操作過程中提取RNA不被環境中的RNA酶降解,試驗在操作過程中嚴格無菌,操作人員戴一次性口罩、帽子、手套,實驗過程中手套要勤換。本試驗在常規PCR的基礎上進行優化,擴增效果理想,采用外引物、內引物進行套式RT-PCR,靈敏性和特異性較好。所以可用該方法進行臨床樣品快速診斷雞傳染性法氏囊病,并對該病的流行病學調查有重大意義。

[1] Jackvood D J,Saif Y M,Hugbes JH.Characteristics and serologic studies of two serotypes of infeetious bursal disease virus intorkeys[J].Avian Dis,1982,20:871-882.

[2] 程安春.雞病療治大全[M].北京:中國農業出版社,2000:134-144.

[3] 甘孟候.中國禽病學[M].北京:中國農業出版社,1999:55-66.

[4] 劉高裕,劉秀梵,崔治中.傳染性法氏囊病的研究進展[J].動物醫學進展,2001,22(3):44-49.

[5] Reddy S K,Silim A.Com parison of neutralizing antigens of recent isolates of infectious bursal disease virus[J].Arch Virol,1991,117:287-296.

[6] Jackwood D J,Saif Y M,H ughes JH.Nucleic acid and structural proteins of infectious bursal disease virus isolates belonging to serotypeⅠandⅡ[J].Avian Dis,1984,28(4):990-1006.

[7] 劉文利,趙德明.應用復合中草藥提取物對IBD中等毒力活疫苗免疫增強作用的研究[J].動物醫學進展,2008,29(9):35-41.

[8] Hassan M K,Nielsen C K,Ward L A,et al.Antigenicity,pathogenicity,and immunogenicity of small and large plaque infectious bursl disease virus clones[J].Avian Dis,1996(40):832-836.

[9] 馬增軍,芮 萍,李佩國,等.雞傳染性法氏囊病病毒地方流行毒株的免疫原性[J].中國獸醫學報,2007(2):164-167.

[10] 李建榮,周繼勇.傳染性法氏囊病病毒變異株弱毒的免疫原性研究[J].中國預防獸醫學報,2000(5):32-34.

[11] 崔治中,孫淑紅,單忠芳,等.雞傳染性法氏囊病病毒超強毒株GXS/99株的致病性[J].病毒學報,2002,18(2):162-166.

[12] Heppell J,Tar rab E,Berthiaume L,et al.Characterization of the small open reading frame on genome segment A of infectious pancreatic necrosis virus[J].J Gen V irol,1995;76:2091-2101.

[13] 孫運高.雞傳染性法氏囊病的預防與控制[J].山東畜牧獸醫,2008(8):21.

[14] 楊保收,尤永君.我國今年來雞傳染性法氏囊病的發病特點、控制對策及治療措施[J].動物科學與動物醫學,2004,21(4):1-3.

[15] 張光明,藺如濤.淺談中草藥在雞病防治中的應用[J].山東獸藥,2002,2(5):18-19.