Ⅱ型單純皰疹病毒糖蛋白D在桿狀病毒表達系統中的表達*

姜德玉,劉 坤,趙曉燕,張 偉,李君麗,王希良,于三科*

(1.西北農林科技大學動物醫學院,陜西楊陵712100;2.軍事醫學科學院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點實驗室,北京100071)

Ⅱ型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus 2,HSV-2)感染可引起生殖器皰疹[1],其發病率在性病中僅次于淋病和梅毒[2]。如果孕婦感染HSV-2則極易產生流產或造成胎兒先天畸形和智力低下,60%～70%受感染新生兒可因此而死亡,幸存者中95%伴有后遺癥。在美國每年造成的直接經濟損失超過2億美元[3]。此外,HSV-2感染可增加艾滋病和宮頸癌的感染機率[4]。使用疫苗將是最經濟有效防控HSV-2感染的方法,但目前仍沒有臨床可用的HSV-2疫苗。

HSV-2疫苗主要有全病毒滅活苗、減毒苗、亞單位苗和核酸疫苗等多種形式[5],其中亞單位疫苗研究進展最為明顯。G laxo Smithk line疫苗研究組研發的糖蛋白D-AS04亞單位疫苗具有良好的免疫原性,這種疫苗已經在進行Ⅲ期臨床擴大試驗,有望成為最先上市的HSV-2疫苗。

糖蛋白是HSV-2的主要免疫原,可誘導細胞和體液免疫應答,產生高滴度的中和抗激發遲發型超敏反應和T細胞增殖。HSV-2的11種糖蛋白中糖蛋白D(glycoprotein D,gD)是宿主體液免疫反應的主要靶標之一,能誘導產生較高水平的中和抗體,成為亞單位疫苗的首選[5-6]。

本研究基于桿狀病毒表達體系,將Ⅱ亞單純皰疹病毒優勢靶標糖蛋白D轉座至穿梭質粒,最后形成重組桿狀病毒。再利用真核表達體系表達更接近天然構象的蛋白,為下一步對此種亞單位疫苗的評價奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細胞 HSV-2 333株(GenBank Z86099)、Vero細胞、DH 5α感受態細胞、DH10Bac感受態E.coli和Sf9細胞由軍事醫學科學院微生物流行病研究所免疫室保存。

1.1.2 主要試劑 低分子質量蛋白Marker、DNA Marker DL 2 000/15 000、MiniBEST V iral RNA/DNA Extraction Kit Ver 3.0試劑盒、各類酶以及pMD18T vector均為寶生物工程(大連)有限公司產品;pFastBacⅠ質粒載體、CellfectinⅡReagent脂質體轉染試劑盒、通用引物均為Invitrogen公司產品;HSV-2 gD antibody(A 33)(sc-80824)為Santa Cruz公司產品;辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠IgG為北京鼎國生物技術有限責任公司產品。1.1.3 引物 引物由上海生物工程技術服務有限公司北京合成部合成,共計4條引物:

P1與P2為gD特異性引物方框內分別是EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點。P3與P4為通用性引物。

1.2 方法

1.2.1 全病毒DNA提取及gD基因的擴增 生長良好的單層Vero細胞上培養HSV-2 333病毒,病毒收獲后取病毒液使用TAKARA公司M iniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer 3.0試劑盒,參照其提供的說明書提取HSV-2 DNA。取2μL HSV-2 DNA作為模板,用特異性引物P1和P2進行RCR反應:94℃5 min;94℃45 s,55℃45 s,72℃120 s,循環25次;72℃10m in。命名PCR產物為gD,使用寶生物工程(大連)有限公司的膠回收試劑盒回收純化PCR產物,用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.2 重組質粒的獲取及鑒定 將gD連接到pMD18T載體上,轉化至DH 5αE.coli,保存于-80℃。用Eco RⅠ和XbaⅠ酶對gD和桿狀病毒轉移載體pFastBacⅠ進行雙酶切,然后與從pMD18T-gD上雙酶切下的gD進行連接,連接產物轉化到DH 5α感受態細胞中。小量提取質粒,利用雙酶切方法鑒定、選取陽性克隆,送上海生工生物工程技術服務有限公司測序驗證。測序正確后,提取pFast BacⅠ-gD質粒轉化DH10Bac感受態細胞,pFastBacⅠ-gD質粒和DH10Bac感受態細胞中的穿梭質粒Bacmid進行轉座,產生重組穿梭質粒Bacmid-gD,挑取陽性轉座株堿裂解法提取Bacmid-gD,用特異性引物P1/P2以及通用引物P3/P4進行PCR鑒定。

1.2.3 轉染及重組桿狀病毒的獲取與鑒定 轉染按照Invitrogen公司Bac-to-Bac·Baculovirus Expression System說明書提供的方法進行。6孔板每孔鋪8×105個Sf9細胞,待細胞全部貼壁按質脂體轉染法混合8μLCellfectinⅡReagent與1μg重組DNA轉染細胞。轉染72 h后收集細胞培養上清,用培養上清繼續感染細胞,經過3代擴大培養后,收集培養上清作為重組病毒母液,4℃避光保存備用。

1.2.4 重組桿狀病毒TCID50的檢測 使用半數組織細胞感染量方法測定病毒毒力。測定方法如下,鋪一定量的Sf9細胞于96孔板中貼壁,重組桿狀病毒連續作10倍稀釋從10-1開始同時設空白對照。加入不同稀釋度的病毒感染昆蟲細胞,27℃作用1 h后,去除含病毒的上清,換上新鮮培養基。27℃培養7 d～10 d,觀察細胞病變。

1.2.5 重組蛋白的表達 重組桿狀病毒感染培養的Sf9細胞,預設感染指數(multiplicity of infection,MOI)為5,細胞密度為5×105cells/mL,27℃培養72 h,分別收集細胞培養上清和沉淀,將沉淀用預冷的PBS洗滌3次,加入細胞裂解液,30 min內迅速反復凍融3次,于4℃以9 000 r/min離心15m in,將上清收集后于-20℃保存備用。用120 g/L的SDS-PAGE檢測細胞裂解后的上清,轉到硝酸纖維素膜上,電轉條件為90 V、90m in,用含50 g/L脫脂奶粉的TBS緩沖鹽溶液(Tris堿3.03 g,NaCl 8.18 g,去離子水定容到1 000mL;pH 7.5)封閉膜2 h。一抗為鼠抗HSV-2單克隆抗體,二抗為1∶6 000倍稀釋的辣根過氧化氫酶標記的羊抗鼠IgG。

2 結果

2.1 重組桿狀病毒的獲得與鑒定

以HSV-ⅡDNA為模板擴增gD基因,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示,得到1條約875 bp的目的片段,大小與預期片段的大小一致,陽性質粒測序鑒定,其結果與預期序列完全一致。桿狀病毒重組轉移載體pFastBacⅠ-gD雙酶切鑒定結果見圖1。用通用引物和特異性引物進行PCR鑒定重組桿狀病毒穿梭質粒,結果見圖1,表明gD基因已經克隆到到桿狀病毒穿梭質粒Bacmid中。

圖1 瓊脂糖電泳圖Fig.1 Agarose gelelectrophoresis of PCR products of gD

2.2 重組桿狀病毒轉染后細胞病變觀察

顯微鏡觀察轉染24 h后,細胞停止擴增不再生長。48 h～72 h后細胞直徑逐漸變大,細胞核增大且充滿整個細胞,隨著轉染時間延長,細胞邊緣漸模糊,96 h后細胞破碎(圖2)。由此可見重組病毒轉染成功。

圖2 重組桿狀病毒感染的細胞病變(200×)Fig.2 CPE of Sf9 cellsafter transfection of recom binant bacm id(200×)

2.3 重組桿狀病毒毒力檢測

通過觀察昆蟲細胞病變得到半數細胞感染量,再由此半數細胞感染量結果算出重組桿狀病毒毒力為7.5×107pfu/mL(p fu=TCID50×0.69)。

2.4 SDS-PAGE和Western blot檢測重組蛋白

細胞感染重組病毒72 h后,收獲細胞凍融離心得到上清,用120 g/L分離膠進行SDS-PAGE,試驗組與正常細胞無明顯差異。Western blot結果表明,重組病毒表達蛋白中有特異性條帶出現,結果出現位置35 ku與預期一致(圖3)。

圖3 表達產物SDS-PAGE及Western blot試驗結果Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of products expressed in Sf9 cells

3 討論

桿狀病毒昆蟲表達系統是表達外源重組蛋白的主要工具之一,相比于其他表達系統,該系統具有諸多優點,該表達系統能夠穩定且高水平的表達外源蛋白[9],其表達的重組蛋白均具有天然活性。首先,此系統不需要多輪篩選純化重組病毒,顯著縮短了工作周期。其次,昆蟲細胞要求的培養環境相對寬松,一般實驗室都可以滿足昆蟲細胞生長條件并適于擴大培養。最后,桿狀病毒感染具有很強宿主特異性不會形成交叉污染。

Ⅱ型單純皰疹病毒尚沒有上市疫苗,主要是此病毒的致病機制呈現不全,其中包括潛伏機制和復發機制等,成為疫苗研究的障礙。之前的研究多集中體液免疫反應,而臨床試驗結果陸續證明僅提高體液抗體水平不能全面保護機體不受感染[7-8]。近期不斷出現關于細胞免疫方面的報道使單純皰疹病毒疫苗研制的成功提供又一保證。研究證明糖蛋白D分子具有多個中和抗體表位及細胞免疫反應表位[9-12]。

單純皰疹病毒糖蛋白D作為病毒進入機體及介導免疫反應的主要靶標分子,已在不同的表達系統進行表達。但大多表達產物都具有H IS之類的外源標簽,這對后續疫苗產品的形成帶來了儲多不便。本試驗采用Invitrogen公司已經商業化Bac-to-Bac Baculovirus Expression System表達無標簽去除信號肽部分糖蛋白D,經分子水平及蛋白水平的鑒定確有特異性表達。現行病毒毒力的測定多采用空斑試驗,但由于此種方法操作較復雜且需時較長,所以本試驗使用半數組織細胞感染量的方法,得出病毒毒力。從試驗結果看,重組蛋白經各個條件的摸索及優化確有相對較高的表達,這樣可以后續試驗將繼續純化重組蛋白并對其免疫原性進行一系列評價為進一步研制HSV-2重組蛋白疫苗奠定基礎。

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