均勻設計法優選中藥免疫復方的試驗

張 明

(菏澤學院生命科學系,山東菏澤274015)

多糖作為免疫活性成分對免疫功能的調節作用已經得到了證實[1-3],中藥單方提取大多數都是以某一成分為指標,然后去研究其化學成分及其機理,而機體是一個多靶點、多層次、非線性的免疫系統,僅僅單方成分無法達到整體的免疫效果,隨著中藥現代化進程的加快,中藥免疫復方的研究越來越受到重視[4-6]。本試驗采用索式提取器連續回流提取法[7],應用免疫學原理和均勻試驗設計相結合,以免疫器官指數(a)、巨噬細胞吞噬活性(b)和淋巴細胞增殖率(c)三項加權作為綜合指標(t=0.2a+0.4b+0.4c),從器官、細胞水平上研究復方中草藥多糖與免疫功能之間的相關性及回歸關系,從而優選出最佳免疫復方,以其為中草藥免疫增強劑以及保健酒、保健飲料的配方開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 黃芪、枸杞、人參和當歸購于菏澤牡丹藥店中藥科。

1.1.2 實驗動物 健康昆明小鼠120只,體重18 g～22 g,購于菏澤醫學專科學校動物飼養中心。

1.1.3 儀器 DG-3022型酶聯免疫檢測儀為國營華東電子管廠產品;CO2培養箱為美國Reveo公司產品;75-2A型微量振蕩器為上海醫用分析儀器廠產品;恒溫培養箱為天津市津北真空儀器廠產品;倒置顯微鏡及照相系統(O lym pus IX-50)為重慶光學儀器產品;721紫外分光光度計為上海第二儀器廠產品;96孔細胞培養板為德國Nunclon公司產品;RPM I1640培養液為Gibco公司產品;四甲基偶氮唑藍(MTT)為Amresco公司產品;易得小鼠淋巴細胞分離液為達科為生物技術有限公司產品;二甲基亞砜(DMSO),分析純,為Amresco公司產品。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 根據中藥復方配伍原則,選取4種免疫效果好的中草藥通過DPS統計軟件對4個因素6水平進行均勻設計優選,優選方案見表1。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.2.2 水溶醇提法 取黃芪、人參、枸杞和當歸粗粉按表1比例,置索式提取器圓底燒瓶中,按液固比為20∶1、提取溫度為100℃、提取時間170 min,醇沉淀濃度比85%,回流提取,提取2次,濾過,合并濾液,用旋轉蒸發儀減壓濃縮,冰箱中放置24 h,最后2 000 r/min離心15 min,反復洗滌2次,最后真空干燥箱烘干,采用硫酸-苯酚法測其含量和得率[8]。

1.2.3 中藥復方對小鼠免疫功能的影響

1.2.3.1 試驗分組與動物處理 將120只(雌雄各半)試驗小鼠,按照均勻設計隨機分為6組,每組20只;小鼠禁食12 h后,試驗用6組中藥復方提取的多糖經計算按2 mg/kg藥量每日灌胃0.5mL,連續7 d,于最后1次灌胃24 h后,每組隨機取10只用于免疫器官指數觀察,5只用于巨噬細胞吞噬活性的觀察,另外5只無菌取脾,制成單個脾細胞懸液,用于測定脾淋巴細胞的增殖反應。

1.2.3.2 小鼠脾免疫器官指數的觀察 每組取10只小鼠解剖后無菌取脾,電子天平稱量脾重量和小鼠重量,計算免疫器官指數(免疫器官指數等于脾重量除以小鼠的重量)。

1.2.3.3 小鼠巨噬細胞吞噬活性的測定 取上述每組5只小鼠,按常規方法無菌收集腹腔巨噬細胞,經2 000 r/min離心,洗滌后,將收獲的細胞懸浮于RPM I1640培養液中,分別調整細胞的濃度為1×106個/mL,接種于30 mm直徑的培養皿中,置37℃中培養箱培養2 h后,棄上清液,用培養液充分洗滌培養皿3次以上,去除非貼壁細胞,臺盼蘭排斥法檢測細胞存活率大于95%,取細胞懸液5mL于6mm直徑的培養皿中,依次加入辣根過氧化物酶緩沖液100μL,37℃培養箱中15 min,分光光度計600 nm檢測OD值[9](測OD值等于加藥處理的OD值減去對照的OD值,然后除以對照的OD值)。

1.2.3.4 脾淋巴細胞增殖試驗 取上述5只小鼠頸椎脫臼處死,無菌取脾臟,用滅菌生理鹽水沖洗3次,加入5 mL易得淋巴細胞分離液,放入上面裝有100目網孔的尼龍網袋中,用針桶擠壓過濾收集細胞液,2 000 r/m in離心20 min,吸取中間云霧狀白細胞層,用Hank＇s液洗2次。用RPM I1640營養液稀釋成1×106/mL的細胞懸液,分別向96孔細胞培養板中加細胞,每孔100μL,重復4孔。另設無細胞調零孔。將細胞培養板放入體積分數為5%的CO2、37℃培養箱中培養44 h,每孔中加入20μL MTT液,繼續培養4 h取出,各孔吸出上清液,加入DMOS 100μL,在微量震蕩器上混勻使其顏色變澄清,用酶聯免疫檢測儀570 nm下的吸光度作為淋巴細胞增殖的指標(測OD值等于加藥處理的OD值減去對照的OD值,然后除以對照的OD值)。

1.2.4 數據分析 采用DPS9.50數據統計軟件進行設計,運用多因子及互作項逐步回歸統計方法進行分析[10]。

2 結果

2.1 各免疫指標的試驗結果

結果見表2。1、2、3、4、4、5、6組的免疫器官指數分別為0.69%、0.80%、0.74%、0.84%、0.62%、0.76%;吞噬活性分別為24.14%、25.33%、25.22%、26.38%、24.89%、24.17%;淋巴增殖率分別為18.11%、19.34%、18.88%、19.64%、19.11%、18.67%。

2.2 中藥免疫復方對免疫器官指數的影響

通過DPS統計軟件,進行多因子及互作項逐步回歸,結果見表3。由表3可知,除X2和X2×X3與Y之間負相關外,其它各單方及互作項間均達到正相關,而X1、X1×X3和X 1×X 4與Y之間分別達到0.93、0.71和0.80。回歸模型優化方程為Y=0.634 7+0.006 4X1,統計量值F=25.48,p=0.003 8,相關系數R=0.92,表明方程擬合度良好,中藥復方與免疫器官差異顯著,最高指標時組合:X1=30;X2=11.64;X3=9.76;X4=15.76;Y=0.83。

表2 均勻設計試驗與結果Table 2 Uniform design resu lts

表3 中藥各單方及互相作用因素與免疫器官指數的相關性Table 3 The relativity of single drug prescription or interaction factors and immune organ indexes

2.3 中藥免疫復方對吞噬活性的影響

通過DPS統計軟件,進行多因子及互作項逐步回歸,結果見表4,由表4可知,X 2、X1×X 2 X2×X3、X 2×X4與Y之間負相關外,其它各單方及互作項間均達到正相關。由表5可知,X2直接通經系數是-1.30,而X 1×X 3、X1×X4、X 2×X4的間接通經系數分別為0.11、0.04、0.50;X 1×X3、X2×X4的直接通經系數分別為0.75和0.65,而X 2對其間接通經系數分別為-0.19和-1.00。回歸模型優選方程Y=25.709 7-0.124 1X 2+0.001 6X1×X3-0.000 5X1×X4+0.002 1X 2×X 4,統計量值F=4 464.39,p=0.01,相關系數R=0.91,表明方程擬合度良好,中藥復方與巨噬細胞吞噬活性之間差異顯著,最高指標時組合:X1=30;X 2=4;X3=36;X4=6;Y=26.85。

2.4 中藥免疫復方對淋巴細胞增殖率的影響

通過DPS統計軟件,進行多因子及互作項逐步回歸,結果見表6,由表6可知,除X2和X2×X3與Y之間負相關外,其它各單方及互作均達到正相關,而X1、X1×X4與Y之間分別達到0.8、0.84。回歸模型優化方程為Y=17.999 7+0.003 4X1×X 4,統計量值F=9.68,P=0.03,相關系數R=0.80,表明方程擬合度良好,中藥復方與淋巴細胞增殖率之間顯著。最高指標時組合X1=30;X2=5.83;X3=15.63;X4=36;Y=21.71。

表4 中藥各單方及互相作用因素與吞噬活性的相關性Table 4 The relativity of single drug prescription or interaction factors and phagotrophy activity

表5 各單方及互相作用項的通經系數Table 5 The path coefficient of single drug prescription or interaction factors

表6 中草藥各單方及互相作用因素與淋巴細胞增殖率的相關性Table 6 The relativity of single drug prescription or interaction factor and lymphopoiesis rate

2.5 中藥免疫復方對免疫綜合指標的影響

通過DPS統計軟件,進行多因子及互作項逐步回歸,結果見表7,由表7可知,除X2和X1×X2、X2×X3、X2×X4與Y之間負相關外,其它各單方及互作均達到正相關,由表8可知,X2、X1×X3、X2×X4直接通經系數分別為-1.05、0.71、0.39,但綜合分析三者相關系數分別為-0.64、0.60、-0.30,回歸模型優化方程為Y=18.1190-0.076 1X2+0.001 1X1×X3+0.000 9X2×X4,統計量值F值=31.43,P=0.03,相關系數R=0.97,表明方程擬合度良好,中藥復方與免疫綜合指標差異顯著。最高指標時組合X1=30;X2=4;X3=36;X4=36;Y=19.10。

表7 中草藥各單方及互相作用因素與免疫綜合指標的相關及顯著性Table 7 The relativity of single drug prescription or interaction factors and overall evaluation indexes

表8 各單方及互相作用項的通經系數表Table 8 The path coefficient of single drug prescription or in teraction factors

2.6 驗證試驗

取4種中草藥粗粉,按X1=30;X 2=4;X 3=36;X 4=36配方提取復方分別測免疫器官指數、吞噬活性和淋巴細胞增殖率及綜合指標,結果分別為0.83、26.30、19.15和18.72,此驗證結果與均勻設計試驗預測結果基本接近。

3 討論

均勻設計法是一種多因素多水平試驗設計方法,該方法通過各因素及互作項與測定指標之間建立回歸模型,找出各因素及互作項的測定指標的相關性及顯著性,再通過通經系數進一步尋找該配方中各因素及互作項對其的影響,最終優選出適宜的中草藥免疫復方。

中藥成分比較復雜,而生物體是一個多位點、多靶點復雜的體系,如果想單一把某種活性成分提取出來,然后再組合起來驗證其功效,事倍功半,而中藥之所以能治療一些疑難雜癥,可能是其中的某一個主要成分或者幾個成分相互協調共同作用的結果,因此,單方提取純化再組合就可能失去了某種有效成分,達不到其真正的療效,而復方提取基本保持了原有的有效成分。可能在復方中,不僅各單藥之間存在顯著相關性,而且兩兩中藥間存在互作效應,而且差異顯著,本試驗中黃芪和人參表現為協同效應,并且二者差異顯著,而枸杞和當歸也表現為促進作用,但差異不顯著。通過免疫綜合指標來代替免疫器官指數、吞噬活性和淋巴細胞增殖率3個單個免疫指標,從而建立一個全面的免疫復方篩選方法,本試驗最優免疫復方組合為黃芪30 g,枸杞4 g,人參36 g,當歸36 g,復方多糖含量49.15%,多糖得率為8.66%。

致謝:2006級生物科學班李苗苗、盧惠同學和朱道玉主任對該研究給予了支持和幫助,特此感謝。

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