PRRSV和PCV-2二重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用*

王 林,吳發(fā)興,吳美芹,高許雷,李 平,4,朱紫祥,5,張燕霞,張 志,李曉成*,單 虎

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué),山東青島266109;2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島266032;3.招遠(yuǎn)市畜牧局,山東煙臺265400;4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),新疆烏魯木齊830052;5.西北農(nóng)林科技大學(xué),陜西楊陵712100)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrone,PRRS),俗稱“豬藍(lán)耳病”,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrone virus,PRRSV)引起的一種急性傳染病,主要引起妊娠母豬繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病[1-2]。豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動物病毒,具有PCV-1和PCV-2兩種血清型。PCV-1無致病性,但廣泛存在于豬體內(nèi)及豬源傳代細(xì)胞系。豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV-2)具有致病性,可引起豬體質(zhì)下降、消瘦、腹瀉,還可表現(xiàn)出生長發(fā)育不良、皮膚蒼白、肌肉衰弱無力,甚至出現(xiàn)貧血、黃疸等癥狀[3]。

兩種病毒在臨床上常呈混合感染,都可引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙[4-5]。目前,可用血清學(xué)方法或病毒分離鑒定對這兩種病原的感染進(jìn)行診斷[6],但是耗時長,靈敏度低,不能滿足生產(chǎn)上的需要。多重PCR技術(shù)是在同一PCR體系中加入多對引物,對多個目的基因同時進(jìn)行擴(kuò)增的分子生物學(xué)診斷方法,可同時檢測多種病原體或多個基因型,達(dá)到對多種疾病的同步診斷,縮短檢測時間的目的[7-9]。為此,我們開展了二重PCR技術(shù)檢測PRRSV、PCV-2的研究,建立同時快速鑒別診斷兩種病毒的方法。本研究根據(jù)二重PCR引物設(shè)計要求設(shè)計各自PCR引物,在優(yōu)化單項PCR檢測方法的基礎(chǔ)上,初步建立了敏感的二重PCR檢測方法,為預(yù)防和控制這兩種疾病提供快速診斷方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞毒參考毒株 PRRSV、PCV-2、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬流感病毒(SIV)細(xì)胞毒參考毒株均由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心監(jiān)測室提供。

1.1.2 組織病料的來源及處理 臨床組織病料是2009年秋季,采集于河北省和安徽省不同類型的發(fā)病豬場或養(yǎng)殖戶的疑似發(fā)病豬以及屠宰場。無菌操作剪取1.0 g～2.0 g病料,加少量滅菌PBS(含青霉素、鏈霉素),剪碎,用無菌研磨器研磨至糊狀,再用PBS按1∶4的體積比稀釋成懸液,樣品經(jīng)處理后分管置-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑 DNA zol Regent、Trizol Regent均購自Invitrogen公司;AMV反轉(zhuǎn)錄酶、Rnase-Inhibitor、r Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL 2 000等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)基因庫提供的PRRSV和PCV-2基因序列,通過Blast分析軟件分別對基因的序列進(jìn)行分析,選擇了PRRSV的N sp2基因序列和PCV-2的ORF1基因序列,應(yīng)用計算機(jī)Primer軟件設(shè)計了兩對特異性引物以及針對RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄引物(表1),引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 二重PCR引物設(shè)計結(jié)果Table 1 Resultsof p rimer design for duplex PCR

1.2.2 病毒核酸的抽提 取細(xì)胞毒參考株,按Invitrogen公司的DNAzo l Regent DNA試劑盒的操作說明書和TRIzol LS·Reagent RNA試劑盒,提取病毒基因組DNA/RNA。

1.2.3 單項PCR檢測方法的建立

1.2.3.1 RNA病毒RT-PCR的最佳反應(yīng)條件PRRSV反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)總體積為20μL:5×AMV bu ffer 4μL,AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL,RNase抑制劑0.5μL,RT引物1μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4μL,DEPC滅菌水7μL,病毒RNA模板3μL,混勻,42℃水浴作用1.5 h,即得到cDNA模板,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RT-PCR反應(yīng)條件:總體積為25μL,10×PCR bu ffer 2.5μL,dNTPM ix ture(2.5 mmol/L)2μL,上下游引物各0.5μL,Taq 0.5μL,滅菌雙蒸水16μL,cDNA模板3μL。

RT-PCR擴(kuò)增條件:95℃5 m in;94℃50 s,55℃50 s,72℃1 m in,循環(huán)35次;72℃延伸10 min。

1.2.3.2 DNA病毒單項PCR的最佳反應(yīng)條件PCV-2的最佳反應(yīng)體系:總體積為25μL,10×PCR Bu ffer 2.5μL,dNTP M ix ture(2.5 mmol/L)2μL,上下游引物各0.5μL,Taq 0.5μL,滅菌雙蒸水16μL,DNA模板3μL。

最佳擴(kuò)增條件:95℃5 m in;94℃50 s,54℃50 s,72℃1 min,循環(huán)35次;72℃延伸10m in。1.2.4 二重PCR方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化 引物用量:加入的引物量(上下游引物的分別用量)選擇PRRSV/PCV-2為:0.5μL/0.5μL、0.5μL/0.4μL、0.4μL/0.4μL、0.4μL/0.3μL、0.3μL/0.3μL、0.3μL/0.25μL、0.25μL/0.25μL、0.25μL/0.2μL、0.15μL/0.25μL、0.15μL/0.15μL不同用量進(jìn)行擴(kuò)增。

dNTP用量:分別選擇1、1.5、2、2.5、3、3.5、4μL不同用量進(jìn)行擴(kuò)增。模板用量:雙模板擴(kuò)增分別選擇PRRSV/PCV-2為:4μL/4.5μL、4μL/4μL、4μL/3.5μL、4μL/3μL、3μL/4μL、3μL/3.5μL、3μL/3μL、3μL/2.5μL、3μL/2μL、2μL/3μL、2μL/2.5μL、2μL/2μL進(jìn)行擴(kuò)增。

反應(yīng)溫度:退火溫度分別選擇52、53、54、55、56、57、58、59、60℃進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.5 二重PCR的特異性試驗 以建立的二重PCR檢測方法,對PRRSV、PCV-2、CSFV、PRV、PPV、SIV細(xì)胞毒等分別進(jìn)行PCR操作,驗證該二重PCR檢測方法的特異性。

1.2.6 二重PCR的敏感性試驗 將提取的DNA模板和cDNA模板,分別進(jìn)行10倍系列稀釋,并將二者按各個稀釋度混合,按已優(yōu)化的PCR反應(yīng)的最佳條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以確定最小檢測量。

1.2.7 二重PCR的重復(fù)性試驗 以建立的二重PCR檢測方法,重復(fù)3次,以驗證結(jié)果的可靠性。

1.2.8 二重PCR的初步應(yīng)用 對2009年秋季河北省和安徽省的143份臨床疑似病料進(jìn)行檢測。將疑似病料(肝、肺、脾、腎等),加入少量滅菌PBS,用無菌研磨器研磨至糊狀,再用PBS按1∶4的體積比稀釋成乳劑,于-20℃、37℃反復(fù)凍融3次,在4℃以8 000 r/m in離心10min,取上清,用于提取核酸進(jìn)行二重PCR和單項PCR的檢測。

2 結(jié)果

2.1 單項PCR擴(kuò)增結(jié)果

以RRRSV的cDNA和PCV-2的DNA為模板,分別用各自特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,PRRSV、PCV-2均擴(kuò)增出清晰條帶,大小分別與預(yù)期的421 bp、714 bp結(jié)果相符(圖1)。

2.2 二重PCR反應(yīng)條件的確定

試驗通過對反應(yīng)系統(tǒng)中PRRSV和PCV-2兩對引物的用量、dNTP用量、模板用量、反應(yīng)溫度等多項實驗,對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。在相同反應(yīng)條件下,本著條帶較亮、二聚體較少、試劑用量較少的原則,確定反應(yīng)條件。即在25μL反應(yīng)體系中,PRRSV的上下游引物用量分別為0.25μL、PCV-2的上下游引物用量分別為0.2μL,PRRSV的cDNA的模板用量為3μL、PCV-2的DNA的模板用量為2.5μL,10×PCR bu ffer 2.5μL,dNTPM ixture 2μL,Taq 0.5μL,滅菌雙蒸水13.6μL。在此條件下,二重PCR以如下反應(yīng)程序為佳:95℃5 min;94℃50 s,55℃50 s,72℃1 m in,循環(huán)35次;72℃延伸10 min。在最佳反應(yīng)條件下,二重PCR擴(kuò)增的目的條帶與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。

圖1 單項PCR的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of monomial PCR

圖2 二重PCR的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The resu lts of duplex PCR

2.3 二重PCR特異性試驗結(jié)果

采用該研究建立的二重PCR擴(kuò)增條件,對RRRSV、PCV-2、CSFV、PRV、PPV、SIV以及PRRSV/PCV-2的cDNA/DNA的模板人為混合后進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果含有PRRSV和PCV-2的核酸樣品均成功地擴(kuò)增出與試驗設(shè)計相符合的PRRSV 421 bp的目的片段,PCV-2 714 bp的目的片段。不含此兩種核酸的樣品,沒有條帶出現(xiàn)(圖3)。

圖3 二重PCR特異性試驗Fig.3 Specific assay of duplex PCR

2.4 二重PCR敏感性試驗結(jié)果

在上述引物用量、dNTP用量、模板用量、反應(yīng)溫度等優(yōu)化條件下,該二重PCR方法擴(kuò)增的cDNA/DNA模板以及1∶10、1∶102、1∶103、1∶104均出現(xiàn)可見的目的條帶(圖4)。

圖4 二重PCR擴(kuò)增的敏感性試驗Fig.4 Sensitivity assay of duplex PCR

2.5 二重PCR重復(fù)性試驗結(jié)果

以建立的二重PCR檢測方法,重復(fù)3次,結(jié)果在421 bp處和714 bp處,均得到了清晰可見的目的條帶。

2.6 二重PCR的初步應(yīng)用

對來自河北省和安徽省的143份臨床病料進(jìn)行了二重PCR擴(kuò)增試驗,單純感染PRRSV的有28份,單純感染PCV-2的有41份,既感染PRRSV又感染PCV-2的有22份。

將二重PCR擴(kuò)增實驗結(jié)果與單項PCR擴(kuò)增試驗結(jié)果比較,兩者有較高的符合率,其陽性符合率在92.6%以上(表2),結(jié)果表明該多重PCR體系的特異性和敏感性較好。

表2 被檢病料單項PCR與多重PCR檢測對比試驗結(jié)果Table 2 The comparative detection of PRRSV and PCV-2 in clinical samples by monomial PCR and duplex PCR

3 討論

PRRSV和PCV-2是目前危害養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán)重的疾病,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,且兩種病毒臨床上常呈混合感染,給臨床診斷帶來困難[10]。

本試驗在進(jìn)行PRRSV和PCV-2單項PCR的基礎(chǔ)上,通過對病毒引物、dNTP、模板用量及反應(yīng)溫度的篩選,建立了PRRSV和PCV-2二重PCR的快速特異的鑒別診斷方法。

對于二重PCR反應(yīng),引物的設(shè)計至關(guān)重要。引物不僅決定著反應(yīng)程序的退火溫度,而且對建立的二重PCR反應(yīng)的敏感性和特異性也起著很大的影響。二重PCR在一個反應(yīng)管中使用兩套引物,與常規(guī)PCR相比,二重PCR由于同時涉及到了兩種模板和兩對引物,因而容易出現(xiàn)非特異擴(kuò)增或不能擴(kuò)增。這就要求二重PCR中各擴(kuò)增條件更加苛刻,對引物量要求要適當(dāng)。本研究的二重PCR需用于檢測臨床樣品,由于提取的DNA/cDNA模板數(shù)量多,使PCR擴(kuò)增容易出現(xiàn)非特異條帶,要求二重PCR中各擴(kuò)增條件和反應(yīng)成分更加苛刻[11-12]。對引物和模板的量要適當(dāng),過高的引物和模板易造成非特異擴(kuò)增樣品,而特異性擴(kuò)增產(chǎn)物量過多,電泳時出現(xiàn)特異性條帶過寬、亮度太強(qiáng),也會影響其他條帶的鑒定,調(diào)節(jié)引物濃度和模板可以限制過多特異PCR產(chǎn)物的產(chǎn)生。經(jīng)試驗調(diào)節(jié),適當(dāng)減少PCV-2引物量及其DNA模板的用量,適當(dāng)加大PRRSV引物量及其cDNA模板的用量,在其他條件相同的情況下,檢測效果更好[13]。

試驗表明,該二重PCR方法具有很好的敏感性及特異性,能夠快速、準(zhǔn)確的鑒定及區(qū)分PRRSV和PCV-2兩種病毒,能夠應(yīng)用于臨床樣品中PRRSV和PCV-2的單個或混合感染。

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