不同運動強度對男子賽艇運動員紅細胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶的影響

黃紅梅，屈金亭，劉 濤

內(nèi)源性一氧化氮（NO)是由左旋精氨酸（L-A rg)在一氧化氮合成酶（NOS)的作用下產(chǎn)生的，是一種化學性質(zhì)活躍的氣體自由基，亦是一種重要的生物信號分子。在心血管系統(tǒng)中，NO具有擴張血管，抑制血小板黏附和聚集，抑制血管平滑肌細胞和淋巴細胞增殖，以及影響心臟舒縮周期和收縮力等功效[4]。大量研究表明，心血管系統(tǒng)NOSNO系統(tǒng)功能與機體運動形式、強度及持續(xù)時間密切相關(guān)[19]。NOS是調(diào)節(jié)NO合成的關(guān)鍵酶，已確認有3種同工酶：神經(jīng)元型（nNOS)、內(nèi)皮型（eNOS)和誘導型（iNOS)，它們分布的部位、生物效應(yīng)及調(diào)控機制各不相同。研究表明，心血管系統(tǒng)NO主要是由血管內(nèi)皮細胞中內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS)催化合成[17]。最近，Kleinbongard等發(fā)現(xiàn)，eNOS亦存在于紅細胞漿膜，表明紅細胞也是心血管系統(tǒng)內(nèi)NO的主要來源之一[7]。本研究擬觀察不同負荷運動對男子賽艇運動員紅細胞eNOS蛋白表達量/活性和磷酸化水平，以及血漿中 NO含量的變化，以探討紅細胞eNOS-NO系統(tǒng)對于運動刺激的應(yīng)答及可能機制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

專業(yè)賽艇運動員10名（一級和健將級)，年齡21.6± 1.9歲，身高1.89±0.05 m，體重80.5±7.9 kg，訓練年限5.8±1.9年。所有參加實驗的運動員均身體健康，無器質(zhì)性疾病，實驗前48 h內(nèi)受試者均未進行過劇烈運動。

1.2 測試方案

受試者于清晨（6：30～7：30)靜臥15 min，空腹，肘靜脈采血5mL。然后進行劃船測功儀（CONCEPTⅡ，美國)遞增負荷測試來測定受試者的 ˙VO2max，測試前以16槳/ min負荷做5min準備活動，準備活動后休息5min并佩戴好呼吸面罩，起始負荷為20槳/min，每3 min增加2槳，直至力竭。用運動心肺測試系統(tǒng)（Cortex MetaLyzerⅡ，德國)測定耗氧量（˙VO2)、CO2呼出量（VCO2)、呼吸交換律（RER =VCO 2/˙VO2)、每分通氣量（VE)等，用遙測心率表（Polar A 3，芬蘭)記錄心率。受試者休息1周后，進行1次60％ ˙VO2max強度的運動（劃船測功儀)，時間為20min，運動結(jié)束后即刻肘靜脈采血5 mL；休息2天后，進行1次75％ ˙VO2max強度的運動，再休息2天，進行1次90％˙VO2max強度的運動，其運動方式、運動時間以及取血量與第1次相同。

1.3 紅細胞的制備

所有血液樣品均加入38 g/L枸櫞酸鈉（體積比1∶9)抗凝，1 400 g離心10 min，去上清。加入4倍體積 Hank’s平衡鹽溶液（M HBSS)中反復離心3遍，清洗后取紅細胞懸浮于等體積 Hank’s平衡鹽溶液中待測。

1.4 紅細胞eNOS活性及血漿NO-2/NO-3含量測定

依照試劑盒（南京建成生物公司)說明，紫外分光光度計測量紅細胞 eNOS活性，自動生化分析儀測定血漿NO-2/NO-3含量。

1.5 紅細胞eNOS蛋白總量及eNOS磷酸化水平測定

制備紅細胞組織勻漿，考馬斯亮藍法測定蛋白含量。蛋白樣品經(jīng)15％SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)移于PVDF膜。一抗（Santacruz公司)孵育過夜，HRP標記二抗（TBD公司)孵育1 h，ECL顯影。采用凝膠系統(tǒng)分析軟件（上海天能科技公司)，掃描各條帶灰度值，以安靜狀態(tài)為100％，其他3組與安靜時比值，即其相對表達量（％)。Actin作為內(nèi)參蛋白。

1.6 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件包進行處理，結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示，各組比較采用單因素方差分析，P ＜0.05為顯著性水平，P＜0.01為非常顯著水平。

2 研究結(jié)果

2.1 不同運動強度對血漿NO-2/NO-3含量的影響

圖1顯示，與安靜狀態(tài)比較，運動強度為60％和75％ ˙VO2max時，血漿 NO-2/NO-3含量顯著升高（均為 P＜ 0.05)，運動強度為90％˙VO2max時，血漿NO-2/NO-3含量顯著降低（P＜0.05)。

2.2 不同負荷運動對紅細胞eNOS活性的影響

圖2顯示，與安靜狀態(tài)比較，運動強度為60％和75％ ˙VO2max時，紅細胞eNOS活性顯著升高（分別為 P＜0.05和 P＜0.01)。運動強度為90％˙VO2max時，紅細胞eNOS活性顯著降低（P＜0.01)。

圖1 不同運動強度對血漿NO2-/NO3-含量的影響示意圖

圖2 不同運動強度對紅細胞eNOS活性的影響示意圖

2.3 不同運動強度對紅細胞eNOS蛋白總量及eNOS磷酸化水平

圖3顯示，與安靜狀態(tài)比較，運動強度為60％和75％ ˙VO2max時，紅細胞eNOS蛋白總量和 Thr495磷酸化eNOS蛋白量無明顯變化，Ser1177磷酸化eNOS蛋白量顯著升高（分別為 P＜0.05和 P＜0.01)。運動強度為90％ ˙VO2max時，紅細胞eNOS蛋白總量和Ser1177磷酸化eNOS蛋白量顯著降低（均為 P＜0.05)，Thr495磷酸化eNOS蛋白量無明顯變化。

圖3 不同運動強度對紅細胞eNOS蛋白總量及eNOS磷酸化水平的影響示意圖

3 討論

NO作為重要的信號分子，與運動關(guān)系十分密切。研究表明，運動過程中，血液中一定水平的NO可通過環(huán)鳥苷酸通路提高心肌和骨骼肌收縮力；可增加運動中組織氧攝入量和氧消耗量；可通過舒張血管調(diào)節(jié)運動中機體各器官血液重新分布；也可通過刺激 GLU-4轉(zhuǎn)位促進組織葡萄糖轉(zhuǎn)運等[10]。此外，NO還可通過調(diào)控紅細胞變形性影響運動中紅細胞的功能[8]。Sun等報道，大鼠運動前服用一定劑量L-A rg，可改善機體的運動能力，明顯延長遞增負荷運動的力竭時間，推遲疲勞發(fā)生[14]。而注射了NOS抑制劑N-硝基左旋精氨酸（L-NAM E)的人骨骼肌最大收縮速度及輸出功率明顯降低[6]。這表明，運動中維持一定水平的NO可正性調(diào)控機體運動能力。目前的研究主要關(guān)注于運動刺激血管內(nèi)皮細胞以及骨骼肌產(chǎn)生NO的影響，最近發(fā)現(xiàn)，紅細胞亦是心血管系統(tǒng)中NO的主要來源，這與定位于紅細胞漿膜的eNOS密切相關(guān)[7]。研究表明，不同運動強度對紅細胞膜流動性及脂質(zhì)組成的作用效應(yīng)不同[16]。因而，不同運動強度對紅細胞eNOS功能及NO產(chǎn)生也會產(chǎn)生差異性作用，從而影響心血管系統(tǒng)中NO的穩(wěn)態(tài)及生物效應(yīng)。

本研究中，在運動強度為60％和75％˙VO2max時，紅細胞eNOS活性顯著升高，且隨著運動強度的增加而增加，而eNOS總蛋白表達量無明顯變化。當運動強度增加為90％˙VO2max時，紅細胞eNOS蛋白表達量及活性均明顯降低，甚至低于運動前安靜狀態(tài)時的水平。血漿NO含量的變化趨勢與紅細胞eNOS基本一致，提示運動過程中，紅細胞產(chǎn)生的NO是血漿NO總量的重要組成部分。Rassaf等發(fā)現(xiàn)，前臂分別進行20％、30％和40％的最大握力強度運動，前臂靜脈血漿中NO和血流量與運動強度呈正向的線性關(guān)系；而當強度增加至50％和60％時，上述指標與運動強度呈負相關(guān)線性關(guān)系[12]。Copp等報道，短期急性跑臺訓練可使大鼠后肢血管內(nèi)皮細胞eNOS活性及血漿NO含量急劇增加，而力竭運動使上述指標顯著降低，運動后恢復24 h仍然低于安靜對照組[2]。我們認為，低強度和中等強度負荷運動可刺激紅細胞等組織中eNOS表達量及活性升高，舒張血管，增加血流量，以代償運動造成的組織血液供應(yīng)相對不足；而當運動強度進一步增加時，eNOS-NO生物效應(yīng)反而受到抑制，這可能與運動疲勞的形成相關(guān)。

運動可使血流加速，產(chǎn)生搏動性血流并增加血管內(nèi)血流切應(yīng)力，且血流切應(yīng)力隨著運動強度的增加而增加。研究證實，血流切應(yīng)力是運動促血管內(nèi)皮細胞釋放NO的主要生理刺激。Fischer等在體外循環(huán)中發(fā)現(xiàn)，高血流切應(yīng)力亦可顯著激活紅細胞中eNOS[3]。最近，Suhr等的研究表明，短暫的高血流切應(yīng)力可增加紅細胞eNOS的活性，而高頻反復的高血流切應(yīng)力反而會抑制 eNOS的活化[13]。Temiz等發(fā)現(xiàn)，在低水平血流切應(yīng)力下，紅細胞膜呈彈性固態(tài)，而在高水平切應(yīng)力下，紅細胞膜呈液態(tài)[15]。因而，不同運動強度可能通過影響改變血流切應(yīng)力影響紅細胞膜狀態(tài)，從而動態(tài)調(diào)控位于紅細胞漿膜eNOS的穩(wěn)定性及活性。此外，Petibois等發(fā)現(xiàn)，大強度運動可加速紅細胞膜蛋白質(zhì)的脫失與降解[11]，這可能與90％˙VO2max強度運動造成的eNOS表達量快速減少有關(guān)。

除了蛋白表達量的變化，特定氨基酸的磷酸化也決定了eNOS的活性。eNOS主要有 3個磷酸化位點：Ser116、Thr495和 Ser1177，其中，Ser1177磷酸化使eNOS活性增強，而Ser116和 Thr495磷酸化則使eNOS活性減弱。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，60％和 75％˙VO2max的運動強度可使 eNOS （Ser1177)磷酸化水平增加，且隨著運動強度增加而增加。而在運動強度為90％˙VO2max時，eNOS（Ser1177)磷酸化水平降低，eNOS（Thr495)磷酸化水平在各種運動強度中均維持于運動前安靜狀態(tài)水平。研究表明，血管中的血流切應(yīng)力可以激活紅細胞中磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K)-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt)信號通路，從而上調(diào)紅細胞eNOS Ser1177磷酸化水平和NO產(chǎn)量[5]。因而我們推測，低強度和中等強度運動可能通過PI3 K-Akt通路上調(diào)eNOS Ser1177磷酸化水平，從而增加其活性和NO產(chǎn)量。而大強度運動導致的eNOS Ser1177磷酸化水平降低可能與紅細胞eNOS蛋白總量減少有關(guān)，或有其他的抑制機制發(fā)生，其具體調(diào)控機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

1.當運動強度適量時，紅細胞eNOS蛋白表達、活化磷酸化水平以及NO產(chǎn)生隨著運動強度增加而增加，可能是機體對運動應(yīng)激的一種適應(yīng)機制。

2.當運動強度過大時，紅細胞eNOS蛋白表達、活化磷酸化水平以及NO產(chǎn)生受到抑制，可能與運動疲勞的發(fā)生相關(guān)。

[1]夏志，徐飛，劉艷，舒宗禮.一氧化氮與運動[J].中國臨床康復， 2006，10（10)：152-154.

[2]COPP SW，D M H IRA I，K S HAGEMAN，et al.Nitric oxide synthase inhibition during treadmill exercise reveals fiber-type specific vascular control in the rat hindlimb[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2010，298：R478-485.

[3]FISCHER U M，R SCH INDLER，K BRIXIUS，et al.Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes[J].Ann Tho rac Surg，2007，84：2000-2003.

[4]HEUSCH G，K BOENGLER，R SCHULZ.Cardiop rotection：nitric oxide，p rotein kinases，and mitochondria[J].Circulation， 2008，118：1915-1919.

[5]INOUE T，Y SUZUKI，T YOSH IMARU，et al.Nitric oxide p rotectsmast cells from activation-induced cell death：the role of the phosphatidylinositol-3 kinase-A kt-endothelial nitric oxide synthase pathway[J].J Leukoc Biol，2008，83：1218-1229.

[6]JONES A M，D PW ILKERSON，I T CAMPBELL.Nitric oxide synthase inhibition with L-NAM E reducesmaximal oxygen uptake but not gasexchange threshold during incremental cycle exercise in man[J].J Physiol，2004.560：329-338.

[7]KLEINBONGARD P，R SCHULZ，T RASSAF，et al.Red blood cells exp ress a functional endothelial nitric oxide synthase[J]. Blood，2006，107：2943-2951.

[8]M.BOR-KUCU KA TA Y，R B WENBY，H J MEISELMAN，O. K.B.Effects of nitric oxide on red blood cell defo rmability[J]. Am J Physiol Heart Circ.Physiol，2003，284：H1577-H1584.

[9]M ERRY T L，G KMCCONELL.Skeletalmuscle glucose up take during exercise：a focus on reactive oxygen species and nitric oxide signaling[J].IUBMB Life，2009，61：479-484.

[10]M ERRY T L，G K MCCONELL.Skeletal muscle glucose uptake during exercise：a focuson reactive oxygen species and nitric oxide signaling[J].IUBMB Life，2009，61：479-484.

[11]PETIBOIS C，G DELERIS.Evidence that erythrocytes are highly susceptible to exercise oxidative stress：FT-IR spectrometric studies at the molecular level[J].Cell Biol Int，2005， 29：709-716.

[12]RASSAF T，T LAUER，C HEISS，et al.Nitric oxide synthasederived plasma nitrite p redicts exercise capacity[J].Br J Sports Med，2007，41：669-73.

[13]SUHR F，S PORTEN，T HERTRICH，et al.Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes[J].Nitric Oxide，2009，20：95-103.

[14]SUN M W，M F ZHONG，J GU，et al.Effectsof different levels of exercise volume on endothelium-dependent vasodilation： roles of nitric oxide synthase and heme oxygenase[J].Hypertens Res，2008，31：805-816.

[15]TEM IZA A，M A KH ISAROGLU，Z SERCAN，et al.Adhesion of erythrocytes to endothelial cells after acute exercise：differences in red blood cells from juvenile and adult rats[J].Physiol Res，2006，55：381-388.

[16]TSUDA K，A YOSH IKAWA，K KIMURA，et al.Effects of mild aerobic physical exercise on membrane fluidity of erythrocytes in essential hypertension[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2003，30：382-386.

[17]ZHAO X，Y R CHEN，G HE，et al.Endothelial nitric oxide synthase（NOS3)knockout decreases NOS2 induction，limiting hyperoxygenation and conferring p rotection in the postischemic heart[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292：H1541-1550.