青蒿琥酯對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞系HFL-I細(xì)胞膠原合成的影響及機(jī)制

王昌明,張孝飛＊,呂 倩,黃嵐珍,范才文

(1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西桂林 541001;2桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)

肺纖維化是多種病因引起的一種慢性炎性間質(zhì)性肺部病變,多數(shù)患者在發(fā)病 3～8 a后死亡,目前尚無(wú)有效治療方法。肺成纖維細(xì)胞的過(guò)度增生和膠原分泌在肺纖維化形成過(guò)程中扮演重要角色。近年研究發(fā)現(xiàn),青蒿素類藥物除治療瘧疾外,亦具有抗腫瘤及抗纖維化等作用[1,2]。我們前期研究了青蒿琥酯對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)系HFL-I細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制[3]。2009年 6～9月,我們觀察了青蒿琥酯對(duì)體外培養(yǎng)的HFL-I細(xì)胞膠原合成的影響,旨在進(jìn)一步探討其對(duì)肺纖維化的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HFL-I細(xì)胞株(中科院細(xì)胞庫(kù)),青蒿琥酯(純度 ＞99%,廣西桂林南藥公司),碘化丙啶(PI,上海浩然生物技術(shù)有限公司),CCK-8、0.1%天狼腥紅苦味酸染液、胰酶(Sigma公司),D-MEM/F-12培養(yǎng)基,胎牛血清。RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit及PCR試劑盒Prem ix PrimeSTAR HS,引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、1 ×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的D-MEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng), 3 d換液 1次,每 5～6 d傳代 1次;傳 4代以上用于下列實(shí)驗(yàn)。

1.3 青蒿琥酯處理及HFL-I細(xì)胞膠原檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HFL-I細(xì)胞,用D-MEM/F-12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×105/m l,接種至 96孔培養(yǎng)板,每孔200μl,37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后隨機(jī)分為觀察 1～3組及對(duì)照組,前三組分別加入質(zhì)量濃度為1、10、100 mg/L的青蒿琥酯,對(duì)照組加等體積的培養(yǎng)液,每組設(shè) 4個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng) 48 h后吸去培養(yǎng)液,每孔加甲醇100μl,-20℃固定過(guò)夜,PBS洗1次,天狼猩紅室染1 h,0.1%醋酸洗3次,每孔加入0.1μmol/L氫氧化鈉20μl,室溫振蕩1 h,于倒置顯微下攝像,于酶標(biāo)儀 540 nm處檢測(cè)各孔吸光度A值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取其均數(shù)。

1.4 青蒿琥酯處理及Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白 mRNA表達(dá)測(cè)定 HFL-I細(xì)胞種于6 cm板,細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)至80%峰度后同上分組及處理,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,用Trizol試劑提取高質(zhì)量的mRNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA。Ⅰ型、Ⅲ型前膠原及內(nèi)參β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為159、447、300 bp。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性：94℃3min,變性：94℃30 s,退火：61～65℃30 s,延伸：72℃45 s,循環(huán)擴(kuò)增：30個(gè)循環(huán)。半定量RT-PCR法測(cè)定Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA水平,以目的基因/內(nèi)參β-actin值表示, PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示,采用方差分析及t檢驗(yàn),P≤0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

各組HFL-I細(xì)胞膠原、Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn),HFL-I細(xì)胞膠原、Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA表達(dá)均呈劑量依賴性關(guān)系,隨著青蒿琥酯濃度的增加,三指標(biāo)表達(dá)均呈降低趨勢(shì)。

表1 各組HFL-I細(xì)胞膠原、Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA表達(dá)(±s)

表1 各組HFL-I細(xì)胞膠原、Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA表達(dá)(±s)

注：與對(duì)照組比較,＊P＜0.05,△P均＜0.01;與觀察 2組比較, #P＜0.05;與觀察 1組比較,○P＜0.05

組別 HFL-I細(xì)胞膠原(A值)Ⅰ型前膠原蛋白mRNAⅢ型前膠原蛋白mRNA觀察1組 0.608±0.040＊#0.565±0.030△#0.123±0.010△#觀察2組 0.589±0.020＊ 0.448±0.020△ 0.070±0.010△觀察3組 0.412±0.050△#○0.188±0.030△#○0.031±0.000△#○對(duì)照組 0.619±0.050 0.882±0.040 0.295±0.020

3 討論

肺纖維化是多種肺疾病發(fā)展到晚期的共同病理變化。其集中表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積,在肺部,細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一膠原即來(lái)自于活化的成纖維細(xì)胞。由于纖維細(xì)胞的異常增殖及膠原的過(guò)度分泌在肺纖維化過(guò)程中起重要作用[4],故抑制膠原過(guò)度分泌是防治肺纖維化的有效手段。

前膠原是成熟膠原的前體分子,其水平可反映膠原的生物合成活性。侯杰等[5]報(bào)道,Ⅰ、Ⅲ型膠原合成與降解失衡在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起主要作用,在肺泡炎階段或肺纖維化早期主要以Ⅲ型膠原增加為主,此期病變尚可逆轉(zhuǎn),隨后病變轉(zhuǎn)為慢性,則以Ⅰ型膠原沉積為主,形成不可逆轉(zhuǎn)的改變。本研究顯示,青蒿琥酯處理后,人胚肺成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)量降低,Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA表達(dá)減少,即Ⅰ、Ⅲ型前膠原表達(dá)活性降低,人胚肺成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成能力下降,導(dǎo)致成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白量明顯減少,與文獻(xiàn)[6,7]報(bào)道一致。

綜上所述,青蒿琥酯具有抗纖維化作用,可在一定程度上降低膠原的分泌,其機(jī)制可能為下調(diào)Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)。

[1]張佳麗,王增,莊蓓蓓,等.二氫青蒿素聯(lián)合環(huán)氧化酶 2抑制劑抗S180肉瘤作用機(jī)制研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2009,25(3)：308-312.

[2]許光蘭,梁勁松,以敏,等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1在博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠肺泡灌洗液中的表達(dá)及青蒿琥酯的干預(yù)作用 [J].廣西醫(yī)學(xué),2008,30(8)：1119-1121.

[3]青蒿琥酯對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞系 HFL-I細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制[J].山東醫(yī)藥,2010,50(3)：33-35.

[4]趙洪文.肺成纖維細(xì)胞在肺纖維化中的作用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：呼吸系統(tǒng)分冊(cè),1996,16(3)：116-117.

[5]侯杰,戴令娟.川芎嗪、丹參治療大鼠肺纖維化對(duì)Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因表達(dá)的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,1999,22(1)：43-44.

[6]余欣,歐陽(yáng)五慶,張黎,等.玉米幼芽提取物對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型前膠原表達(dá)的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2007,35(7)：15-18.

[7]馬捷,陳麗華,廖榮,等.蒿甲醚、雙氫青蒿素對(duì)小鼠硬皮病模型的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2009,34(2)：207.