含蟾酥膠囊血清誘導人肝癌細胞株凋亡及機制探討

頓愛社,張春菊,呂伯實,劉 帥,侯海峰,呂方啟

(1泰山醫學院,山東泰安 271000;2泰安衛生學校基礎護理教研室; 3泰山醫學院附屬醫院)

蟾酥是我國傳統的名貴中藥材,蟾酥膠囊(CC)是重慶市中醫研究院研制的以蟾酥為主要成分的一種蟾酥制劑,動物實驗和臨床報告表明,蟾酥提取物及各種蟾酥制劑具有治療肝癌的作用[1,2],而利用血清藥理學方法研究蟾酥制劑誘導肝癌細胞凋亡并探討其誘導機制的報道甚少。近兩年,我們采用血清藥理學方法,觀察CC血清對體外培養的人肝癌細胞株BEL-7402凋亡的誘導作用,并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物及主要試劑人肝癌細胞株 BEL-7402購自華西臨床醫學院移植與免疫實驗室,CC水溶液由重慶市中醫研究院提供;純種新西蘭大白兔由華西實驗動物中心提供。培養基RPMI-1640,碘化丙啶(PI),MTT,二甲基亞砜(DMSO)。兔抗人Bcl-2單克隆抗體,SABC免疫組化SABC試劑盒,DNA提取試劑盒。

1.2 含藥血清的制備 參考文獻[3]的方法并作改進。20只新西蘭大白兔(體質量2.0～2.5 kg)隨機分為兩組,各 10只,分別用于制備含藥血清和無藥血清。前者給予CC水溶液灌胃6ml/(kg?d),后者給予以等量NS灌胃,均3 d,兩組均自由進食和飲水。末次灌胃 1 h后,心臟穿刺抽血,4℃冰箱過夜,離心,無菌分離血清,滅活,-20℃保存備用。

1.3 細胞培養及分組 BEL-7402用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液常規培養,至對數生長期,消化收集,分別加入無藥血清(對照組),含10%(實驗1組)、20%(實驗2組)、30%(實驗3組)CC血清的RPMI-1640培養液重懸調整,以1×105/ml接種于培養瓶,分別培養 24、48 h備測。

1.4 各組細胞形態學觀察及細胞抑制率、凋亡率測算 采用倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態學變化情況,用MTT比色法測算各組細胞抑制率[4],用流式細胞術測算細胞周期和細胞凋亡率。

1.5 各組細胞DNA梯度條帶測定 用瓊脂糖凝膠電泳檢測。取PBS洗過的BEL-7402(1×106),按試劑盒說明書抽提細胞中DNA,1.5%瓊脂糖凝膠、100 V恒壓電泳,紫外燈下觀察DNA條帶,用凝膠成像系統采集圖像。

1.6 各組細胞Bcl-2檢測 采用免疫組化SABC法染色,按試劑盒說明書操作。用真彩色醫學圖像分析系統對Bcl-2染色結果進行定量分析,測定其吸光值(A值)。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料用±s表示,組間比較采用t檢驗和方差分析,兩兩比較用LSD法。α=0.05。

2 結果

2.1 各組細胞形態學變化 ①細胞貼壁能力變化：誘導培養 24 h時,實驗 2組細胞貼壁能力明顯下降,部分細胞呈漂浮生長狀態,實驗 1、3組細胞貼壁能力未見明顯變化;48 h時,實驗2組細胞貼壁能力進一步下降,大部分細胞呈懸浮生長,實驗 1、3組細胞貼壁能力有所下降,少許細胞呈懸浮生長。②細胞集落性的變化：誘導培養 24 h,實驗 2組細胞集落生長特性明顯降低,部分細胞呈單個生長狀態,實驗1、3組細胞集落生長特性無明顯變化;48 h時,實驗1組細胞集落生長特性無明顯變化,實驗 2組大部分細胞、實驗 3組有少許細胞呈單個生長狀態。③細胞大小和形狀變化：誘導培養 24 h,實驗2組大多數細胞仍呈梭形,個別細胞變小、變圓,實驗 1、3組細胞大小與形狀未見明顯變化;48 h時,實驗1組細胞大小、形狀仍未見明顯變化,實驗 2組大部分細胞和實驗 3組少部分細胞變小、變圓。對照組細胞培養 24 h時呈集落性、貼壁生長,長梭形,胞質飽滿,折光性強;48 h后,相鄰細胞生長匯合成片,逐漸形成細胞單層,細胞貼壁能力無明顯下降,無細胞脫落。

2.2 各組細胞生長抑制率、細胞周期及凋亡率比較見表1。

表1 各組細胞生長抑制率、凋亡率及細胞周期(±s)

表1 各組細胞生長抑制率、凋亡率及細胞周期(±s)

注：與對照組同時點比較,＊P＜0.05,△P＜0.01

組別 細胞生長抑制率(%)細胞凋亡率(%)細胞周期(%) G1期 S期 G2/M期對照組24 h 0 3.3±0.45 55.8 33.6 10.6 48 h 0 4.3±0.22 54.6 29.9 15.4實驗1組24 h 10.3±0.17＊10.5±0.22＊54.3 33.2 12.5＊48 h 13.6±0.14＊14.6±0.41＊44.1＊ 26.6 29.3＊實驗2組24 h 26.5±0.25△32.6±0.51△50.6 31.0 18.4＊48 h 30.2±0.28△38.5±0.45△40.4＊ 27.7 31.8＊實驗3組24 h 15.6±0.24＊13.3±0.32＊53.3 32.4 14.3＊48 h 18.4±0.16＊23.6±0.54＊43.5＊ 28.4 28.0＊

2.3 各組細胞DNA電泳結果 對照組未見DNA階梯狀電泳條帶,各實驗組均見典型的DNA階梯狀電泳條帶(詳見圖1)。

圖1 凋亡細胞DNA含量電泳分析

2.4 各組Bcl-2表達結果 細胞培養24 h時,對照組及實驗1、2、3組Bcl-2 A值分別為0.80±0.03、0.44±0.03、0.35±0.05、0.42±0.04;48 h時分別為0.75±0.03、0.40±0.04、0.30±0.03、0.32± 0.02。各實驗組Bcl-2 A值均低于對照組(P均＜0.05),與實驗1、3組比較,實驗2組48 h時Bcl-2 A值最低(P均＜0.05)。

3 討論

血清藥理學由日本學者田代真一在 1984年首屆和漢醫藥學會上首次提出[5]。指將單味或復方中藥制劑經口灌胃給動物一定時間后,采集動物血液,分離血清,用此含藥血清進行體外實驗的方法,從機理上更接近口服中藥后體內環境中產生藥理效應的真實過程,克服了中藥粗制劑在細胞藥理實驗上的缺點,提高了實驗結果的科學性。

有研究證實[6～11],原癌基因 Bcl-2是重要的抑制腫瘤細胞凋亡的基因,在抑制細胞凋亡的過程中起重要作用,可以增強細胞的存活力,參與細胞增殖與凋亡動態平衡的調控,Bcl-2異常表達與腫瘤的發生有關。本研究結果發現,各實驗組 BEL-7402與含CC血清共同孵育后,出現了一系列凋亡細胞的生物學特征[12],如細胞變小、變圓,細胞膜完整但有發泡現象等;各實驗組細胞生長抑制率和凋亡率均較對照組明顯升高,提示含 CC血清可誘導肝癌細胞株凋亡。細胞周期分析發現,G1、S期細胞減少, G2/M期細胞增多;細胞Bcl-2表達明顯下調,提示含CC血清誘導細胞凋亡的機制可能是使處于分裂活躍階段的S期細胞減少,使細胞阻滯于 G2/M期,阻止細胞進入下一個分裂周期,抑制細胞增殖,從而導致細胞生長受抑制。含CC血清誘導BEL-7402凋亡的機制可能與下調細胞 Bcl-2表達有關,這與Green等[13]研究結果一致。

本研究中,各實驗組細胞凋亡率均高于對照組,且各實驗組之間比較,誘導48 h時較24 h的細胞凋亡率高,以實驗 2組在誘導 48 h的細胞凋亡率最高。分析原因可能是細胞凋亡率并非一定隨藥物濃度及作用時間增加而增加,在藥物濃度達到一定量、且作用一定時間后,細胞開始凋亡,凋亡率隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長而升高;開始時細胞凋亡率與藥物劑量呈正相關關系;但藥物達到一定劑量后細胞凋亡率不再增加,需等到其他周期的細胞過渡到該周期才有可能被誘發凋亡而繼續發揮其藥物作用。因此我們推測,含 CC血清的最佳濃度應該在20%左右。

總之,CC血清具有良好的誘導肝癌細胞株凋亡的作用,其有望作為一種新的治療肝癌藥物,但其誘導細胞凋亡機制、是否引起肝癌細胞耐藥及臨床應用劑量和療效方面尚不十分清楚,有待于進一步研究。

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