基因芯片技術在中醫藥領域中的應用研究

曹 健，周美啟，楊 影

（安徽中醫學院，安徽合肥 230038）

基因芯片技術是一項融分子生物學、半導體微電子、激光、化學染料、生物住處學等領域各項技術，一次微排列實驗可對上千種基因的表達水平、突變和多態性進行快速、準確檢測的高新技術，主要包括芯片制備、樣品制備、雜交反應、信號檢測和結果分析4個主要步驟，是當今微觀整體研究的一項最新技術。目前，基因芯片技術主要應用于基因表達譜分析、新基因發現、基因突變及多態性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預測、藥物篩選、基因測序等領域。基因芯片的飛速發展引起世界各國的廣泛關注和重視。近年來，應用基因芯片技術在尋找中醫證候的基因組、探索針灸作用機制以及研究中藥療效的基因表達譜方面取得了一定的成果。

1 應用基因芯片技術探討中醫證候的本質

中醫證候是中醫藥研究的核心，證候本質的研究是中醫現代化研究的熱點和難點，如能獲得突破性進展，必將使中醫理論研究取得質的飛躍。應用現代醫學理論和分子生物學技術闡明中醫證候本質是實現中醫藥現代化的基礎和關鍵，具有重大科學意義。中醫藥在功能基因調控方面具有潛在的優勢[1]，通過對足夠數量的同一病位或病性患者的基因表達進行分析，建立辨證要素的基因表達譜數據庫，再相互組合便可建立證型基因表達譜數據庫，以此可作為辨證的客觀規范化標準。

楊裕華等[2]應用基因芯片檢測了“勞倦過度、房室不節”腎陽虛小鼠模型腦基因的改變情況，研究結果提示，腎陽虛模型小鼠基因表達改變涉及生長激素、泌乳素、促性腺激素、黑色素和腦脂肪酸結合蛋白（B-FABP）相關基因；炎癥/免疫、促細胞凋亡相關基因以及影響多巴胺生成的限速酶、影響凝血纖溶機制和精子發育代謝的相關基因。宋潔等[3]觀察了“勞倦過度、房室不節”腎陽虛小鼠模型睪丸基因的改變，共篩選出差異表達基因5 505個，其中上調2 425個，下調3 080個。上調基因前百位中已知基因41個，下調基因前百位中已知基因62個，主要涉及細胞結構/功能、物質/能量代謝、信號轉導/傳遞、炎癥/免疫、細胞凋亡、轉錄/翻譯、增殖/分化及細胞周期等。潘志強等[4]探索絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號通路基因在不同證候H22 肝癌荷瘤小鼠腎上腺中的表達特征，結果提示，不同證候肝癌小鼠的腎上腺組織主動參與了MAPK 信號轉導過程。楊麗萍等[5]則利用基因芯片數據挖掘的最新技術手段——基因功能模塊，從功能模塊水平研究虛寒證發生的分子機制，結果發現，用25個差異基因分類樣本準確率為93%，用11個功能模塊分類樣本準確率為87%～100%。認為基于特征功能模塊法研究基因表達譜更有利于對疾病的闡釋。

2 應用基因芯片技術探討針灸的作用機制

針灸以其明顯的臨床療效已在世界范圍內被廣泛認可，而基因芯片技術是建立在基因探針和雜交測序技術上的一種高效快速的核酸序列分析手段，可以在一次試驗中同時對成千上萬個基因進行分析。針刺既然可引起人體多系統、多功能的同步變化，因此可以設想，通過觀察不同穴位、刺激方法、頻率、強度等，導致有關組織基因轉錄的差異，從而在分子水平全面而深刻地反映其廣泛的作用途徑和治療靶點，探明針刺的作用機制，體現針灸的整體調節作用，完善針灸理論，為臨床治療提供依據和指導。

筆者在既往的實驗中，采用結扎冠狀動脈前降支法復制大鼠急性心肌梗死模型，比較肺經組與模型組、心經組與模型組、小腸經組與模型組的下丘腦基因表達譜變化。結果發現，與模型組比較，肺經組中大于2倍的差異表達基因（包括EST）有26個下調和57個上調，心經組中有34個下調和190個上調，小腸經組中有97個下調和122個上調。就大于2倍的表達基因而言，僅僅在心經組和小腸經組出現促甲狀腺激素釋放激素（TRH）基因表達明顯上調和促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）基因表達明顯下調。認為下丘腦差異表達基因，特別是TRH和CRH 基因表達，可能參與了電針心經、小腸經對急性心肌缺血的保護作用[6-8]。曲怡等[9]應用基因芯片技術研究電針對局灶性腦缺血-再灌注大鼠腦組織基因表達譜的影響，研究結果表明，篩選出的差異表達基因可能參與腦缺血-再灌注后腦損傷的發生及發展過程，并參與了針灸抗損傷的機制。江勵華等[10]采用基因芯片技術觀察了電針治療抑郁癥的機制，結果表明，電針治療抑郁癥的機制與調控凝血、免疫、炎癥反應和凋亡等相關的基因表達有關。

3 應用基因芯片技術探究中藥作用機制

中藥由于所含有效成分復雜、作用靶點不明確、重現性差，難以用現行生物醫學理論解釋，嚴重地制約了中藥的現代化發展。基因芯片作為一種高通量、大規模研究基因功能的新技術，能夠從基因表達水平上闡明中醫藥治病的機制。伴隨后基因組時代的來臨，基因芯片技術平臺可以將中藥的藥性、功能及主治與其對特定模型細胞相關基因表達和調控的影響關聯起來，在分子水平上用現代基因組學的理論來解釋傳統中藥理論及作用機制。

3.1 中藥單方研究

李昊等[11]應用基因芯片研究藤梨根對胃癌細胞的作用，結果表明，ERBB2、TRAILR2、p53、TNF、Cyclin E 基因的表達改變可能與藤梨根殺傷和誘導胃癌細胞凋亡有關。于華蕓等[12]利用基因芯片技術研究寒性中藥黃連對正常大鼠肝臟全基因表達譜的影響，結果提示，黃連可上調炎癥反應、免疫反應、防御反應相關基因，增強抗感染、防御能力，調控代謝、凋亡相關基因，影響P450 家族成員，發揮代謝抑制、抗感染作用。其后，于華蕓等[13]又利用基因芯片技術探討大黃“清熱瀉火解毒”作用的分子機制，結果表明，調控機體防御反應、花生四烯酸代謝相關基因表達，可能是大黃發揮“清熱瀉火解毒”作用的分子機制之一。

3.2 中藥復方研究

毛秉豫等[14]觀察加味四物湯對自發性高血壓大鼠（SHR）的心肌組織基因表達譜的影響。結果表明，陽性基因重疊有18 條，其中高表達的基因有4 條，低表達的有14 條。該方作用靶點較多，可上調或下調SHR 的某些與生物酶、血管活性物質、心肌纖維化、脂肪酸代謝有關基因的表達，這可能是其產生藥理作用的重要因素。王剛等[15]利用基因芯片技術對復方丹參滴丸對心肌梗死大鼠基因表達的影響進行評價和研究，基因芯片結果表明，復方丹參滴丸可通過調節Wnt 信號通路等多個基因和信號途徑來減少心肌梗死模型大鼠心臟缺血區的心肌損傷。袁丁等[16]觀察中藥復方小金丹對人肝癌細胞信號轉導基因表達的影響，結果表明，小金丹能顯著影響SMMC-7721 細胞信號轉導基因表達。

3.3 中藥有效成分研究

呂純芳等[17]應用基因芯片研究藏花素對膀胱移行細胞癌T24 細胞基因表達譜的影響，結果發現，3 mmol/L 藏花素作用于T24 細胞48h 引起該細胞系基因表達譜的廣泛改變，其中表達差異2倍以上的基因共836個，這些差異表達基因的功能涉及多個方面，最為明顯的是與細胞生長調節相關的細胞周期調節基因、細胞凋亡調控基因、DNA 復制相關基因等類型。譚敏等[18]觀察補骨脂素對人乳腺癌MCF-7（ER陽性）細胞基因表達譜的影響。結果顯示，經補骨脂素作用的實驗組細胞樣本與對照組細胞樣本比較，呈現差異表達的基因有1 113個。其中，表達上調的有456個，表達下調的有657個。差異表達明顯的基因主要與細胞凋亡、細胞周期調控、核酸轉譯調節、轉譯因子活性、核苷酸轉移酶活性、血管收縮調節等有關。黃杉等[19]應用基因芯片技術研究黃芩素對白色念珠菌基因表達譜的影響，結果發現，共有522個差異表達基因，其中，上調基因251個，下調基因271個。差異基因功能主要涉及細胞周期、跨膜物質轉運、多藥耐藥、毒力因子及熱休克蛋白等。

4 小結

從基因概念的提出到人類基因組學計劃的完成，基因芯片相關技術得到了飛速的發展。目前，基因芯片技術以其具有高通量、簡便、微縮、集約化、平行化等優點，而廣泛應用于中醫藥領域，主要體現在：中醫證候、中藥藥效及藥理學研究、中藥有效成分篩選研究、中藥毒性及不良反應研究等方面，在基因組學與中醫藥學研究之間架起了一座橋梁，為中醫藥客觀化、定量化、標準化研究提供了技術上的保證。雖然基因芯片技術費用相對昂貴，部分芯片特異性相對較低等局限了其在中醫藥領域的應用，但仍有其廣闊的發展和應用前景。

[1]沈自尹.基因科學和21 世紀中醫藥學的走向[J].上海中醫藥雜志,2000,(10):7-9.

[2]楊裕華,李震.“勞倦過度、房室不節”腎陽虛小鼠模型腦基因芯片研究[J].中華中醫藥雜志,2008,23(5):396-401.

[3]宋潔,李震,張丹,等.“勞倦過度、房室不節”腎陽虛小鼠模型睪丸基因芯片研究[J].中華中醫藥雜志,2010,25(2):213-216.

[4]潘志強,方肇勤,盧文麗,等.基于芯片數據分析絲裂原激活蛋白激酶信號通路基因在不同證候H22 肝癌小鼠腎上腺的表達差異[J].中西醫結合肝病雜志,2009,19(1):27-31.

[5]楊麗萍,黃睿,張洛欣,等.用特征功能模塊法挖掘一個虛寒證家系的基因表達譜[J].中華中醫藥雜志,2010,25(5):683-685.

[6]周美啟,周逸平,汪克明,等.針刺小腸經干預急性心肌缺血大鼠心臟基因表達譜研究[J].中國中醫急癥,2006,15(5):513-515.

[7]周美啟,周逸平,汪克明,等.針刺心經干預急性心肌缺血大鼠心臟基因表達譜研究[J].中國針灸,2006,26(8):587-594.

[8]周美啟,周逸平,汪克明,等.針刺心經、小腸經干預急性心肌缺血下丘腦基因表達[J].安徽中醫學院學報,2007,26(2):18-21.

[9]曲怡,張立德,才麗平,等.電針督脈穴對局灶性腦缺血-再灌注大鼠大腦基因表達譜的影響[J].中華中醫藥學刊,2009,27(1):218-220.

[10]江勵華,王玲玲.電針治療抑郁癥的全基因組表達譜芯片數據分析[J].針刺研究,2010,35(2):83-89.

[11]李昊,楊慧萍,魯小青.應用基因芯片研究藤梨根對胃癌細胞的作用[J].同濟大學學報:醫學版,2010,31(1):45-52.

[12]于華蕓,吳智春,馬清翠,等.黃連對大鼠肝臟全基因表達譜的影響[J].山東中醫藥大學學報,2010,34(4):291-295.

[13]于華蕓,王世軍,季旭明,等.基因芯片技術研究大黃“清熱瀉火解毒”作用機制[J].世界中西醫結合雜志,2010,5(7):572-575.

[14]毛秉豫,郭志軍,康立源,等.加味四物湯對SHR 心肌組織基因表達譜的影響[J].南陽理工學院學報,2009,1(1):76-81.

[15]王剛,崔佩佩,宋生有,等.復方丹參滴丸對急性心肌梗死大鼠基因表達譜的影響[J].藥物評價研究,2010,33(2):98-102.

[16]袁丁,謝佐福,魏莉,等.基因芯片研究小金丹對人肝癌細胞信號轉導基因表達的影響[J].福建醫科大學學報,2010,44(2):107-111.

[17]呂純芳,羅春麗,冀慧瑩,等.藏花素對膀胱移行細胞癌T24 細胞基因表達譜的影響[J].中國中藥雜志,2008,33(13):1612-1617.

[18]譚敏,賓曉農,肖剛,等.補骨脂素對乳腺癌MCF-7 細胞基因表達譜的影響[J].腫瘤防治研究,2009,36(12):1008-1012.

[19]黃杉,孫建英,曹穎瑛,等.黃芩素對白色念珠菌基因表達譜的影響[J].第二軍醫大學學報,2010,31(7):796-799.