兩種不同的上游法處理精液對常規體外受精結果的影響

張 紅，馬 博

（1.廣西醫科大學研究生學院，廣西南寧 530021；2.廣東公安邊防總隊醫院生殖中心，廣東深圳 518029）

上游法是較早用于分離精子的技術之一，由于其操作簡便也是現在多數生殖實驗室使用的精子優選方法[1]。上游法的原理就是活力高的精子可以從離心后的精液沉淀中游出至上層的培養液中[2]。隨著輔助生殖技術的不斷發展，優選精子的上游法也有了其衍生方法。本研究主要比較兩種改良上游法對IVF的受精結果的影響。第一種上游法為：將精子洗滌液（美國 Quinn's）與精液1∶1充分混勻，若精液不液化，則反復吹吸使之液化，然后置于15 ml離心管中，用700×g離心力，離心5 min，離心后去上層液體，將精液沉淀吸出后緩慢置于裝有0.5 ml卵裂液HTF（美國 Quinn's）的5 ml試管底部，然后放置于5%二氧化碳，37℃溫箱中培養15～25 min后將上懸濁液吸出放于另一無菌的5 ml小試管，待用。此種上游法簡稱先離心法，其優點是：操作簡單，節省試驗耗材，能最大程度地回收精子。缺點是：離心后高密度的有缺陷的精子及白細胞會產生高濃度的活性氧，進而使正常精子受到損害[3]，而且在吸取上懸濁液時容易混入死精子及其他雜質。第二種上游法：取3～4支10 ml圓底試管，每支試管加入1.5 ml精子洗滌液，將精子洗滌液與精液1∶1混勻并反復吹吸，然后將精液分為2～3等份，分別緩慢地加入圓底試管底部，然后將含精液試管傾斜45°，置于5%二氧化碳，37℃溫箱中培養30～45 min，培養后將各管上懸濁液吸入15 ml離心管中，以700×g離心力離心5 min，離心后棄去上清液，以0.3～0.4 ml卵裂液HTF與沉淀混勻，待用。此種上游法簡稱先上游法，優點是：減少了異常精子及精漿中的其他雜質對正常精子的損傷；缺點是：操作較復雜，對精子密度要求高。此兩種方法均較傳統的上游法[4]減少了離心次數，而離心可能對精子產生損傷[5]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對2009年2～9月因輸卵管因素不孕在廣東公安邊防總隊醫院生殖中心接受輔助生殖治療的患者進行相關研究分析，為排除干擾因素我們選取夫婦雙方年齡均＜40歲，符合體外受精（in-vitro fertilization，IVF）指征，獲卵個數不少于6個，男方精液量不少于2 ml，共287周期進入此項研究，女方年齡 25～37（29.5±3.5）歲，男方年齡 25～39（31.5±3.2）歲，不孕年限 4～13（8.0±3.1）年，男方精液檢查依照世界衛生組織診斷標準，均為正常。

1.2 方法

1.2.1 臨床技術 所有周期均采用常規促排卵方案，前1個月經周期第 21 天開始降調，達菲林（法國 Signes）0.8～1.5 mg 肌注，月經周期第3天查性激素卵泡生成素、黃體生成素、雌二醇達到降調標準后用果納芬（瑞士 Sereno）或麗申寶（麗珠醫藥）促排卵，當超聲檢查見1個直徑≥18 mm或2個直徑≥16 mm的卵泡時當晚22∶00時給予HCG 8 000～10 000 IU肌注，34～36 h后經陰道超聲引導下取卵。

1.2.2 實驗室技術 將取出的卵子分為數量約等的兩份，均放于5%二氧化碳，37℃溫箱中培養3～6 h，再將已經調整為相似密度的兩種改良上游法優選過的精子分別與兩組卵細胞共培養。16～18 h后觀察受精情況，并每隔24 h觀察胚胎分裂情況至移植當天，以胚胎卵裂球數≥6，卵裂球大小均勻，碎片＜10%的胚胎為優質胚胎[6]。

1.2.3 觀察指標 分別觀察兩組的正常受精率、卵裂率及優質胚胎率

1.3 統計學分析

2 結果

將使用先離心法分離的精子行IVF產生的A組受精卵與使用先上游法分離的精子行IVF產生的B組受精卵進行比對，A組有14個周期完全受精失敗，其中原發不孕9個周期，繼發不孕5個周期，有1 472個卵子行IVF，受精率為72.4%（1 066/1 472），卵裂率為 91.2%（972/1 066），優質胚胎率為52.5%（510/972）。B組中有12個周期完全受精失敗，其中原發不孕8個周期，繼發不孕4個周期，有1 493個卵子行IVF，受精率為 75.1%（1121/1493），卵裂率為 93.2%（1045/1 121），優質胚胎率為53.9%（563/1 045）。雖然B組中各項結果較A組好，但兩組中受精率、卵裂率、優胚率的差異并無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

胚胎的質量是決定不孕患者能否通過輔助生殖技術（ART）成功受孕的主要因素之一，而精子和卵子的質量又決定了胚胎的質量。由于胞漿內單精子注射技術（ICSI）的出現，臨床醫生過多地關注卵子的質量，而忽略了精子在受精過程中的重要作用。現在隨著男科學的不斷發展，精子對胚胎質量的影響越來越多地被臨床醫生認識和了解，如何更簡便地獲得優質的精子，也是生殖領域的研究人員在不斷探索的問題。在優選精子的方法中上游法既操作簡單又能完全實現從精漿中分離活動精子，提高活動精子密度，使精子獲能等分離精子的目的，而由傳統的上游法衍生的改良上游法更是明顯地體現了上游法的優點并為多數生殖實驗室所使用。

本研究對使用兩種不同的上游法分離的精子進行IVF操作，并對受精結果進行分析。雖然B組的受精率、卵裂率、優胚率等三項指標均高于A組，但未發現有統計學意義，這與文獻[3]報道有不同，究其原因可能為先離心法在離心及溫箱內上游時間均短于相關文獻使用的時間，減少了正常精子與異常精子及精漿的接觸時間，或者是本研究的標本數不足，沒有發現統計學上的差異。由于現在越來越多的證據顯示高濃度的死精子、未成熟精子、異常精子、精漿雜質和白細胞會嚴重影響損傷正常精子[3，7]，并有學者認為采用先離心再上游的方法獲得的精子行IVF有可能是導致完全不受精的原因[8]，并且IVF治療周期長，費用高，因此在現有的條件下盡量減少對精子和卵子的損傷也是生殖實驗室工作人員必須要注意的。

[1]湯慧.治療不孕癥精子體外處理上游法和Percoll梯度離心法比較[J].淮海醫藥,2009,27(4)∶57-59.

[2]李媛.人類輔助生殖實驗技術[M].北京∶科學出版社,2008∶71.

[3]劉容菊,李志凌.輔助生殖技術中預防活性氧對精子的損傷[J].生殖與避孕,2007,27(3)∶213-217.

[4]Mahadevan M,Baker G.Clinical in vitro fertilization[M].Berlin∶Springer,1985∶83-97.

[5]王娜.活性氧類物質對精子DNA的損傷及其檢測[J].中國醫藥導報,2009,6(12)∶11-12.

[6]黃荷鳳.現代輔助生育技術[M].北京∶人民軍醫出版社,2003∶232-233.

[7]Ashok A,Rakesh KS,Kiran PN,et al.Reactive oxygen species as an independent marker of male factor infertility[J].Fertility and Sterility,2006,79(4)∶878-885.

[8]Mortimer D.Sperm preparation techniques and iatrogenic failures of invitro fertilization[J].Human Reproduction,1991,6(2)∶173-176.