鈣激活氯通道與哮喘黏液過度分泌及氣道炎癥的關系

姜軼飛， 沈華浩

(浙江大學醫學院附屬第二醫院呼吸科，浙江 杭州 310009)

#現工作單位:浙江省嘉興市第二醫院呼吸科，浙江嘉興 314000

哮喘的一個重要特征是杯狀細胞增生和黏液過度分泌，大量黏液難以清除引起小氣道阻塞并導致氣道高反應性，急性哮喘死亡患者尸檢顯示大小氣道均有杯狀細胞增生和黏液過度分泌，這種黏液過度分泌導致的氣道阻塞是重癥哮喘主要死因之一，有研究證實黏液過度分泌是第1秒用力呼氣容積(FEV1)下降加速的獨立危險因素［1］。一直以來黏蛋白(mucin，MUC)基因被認為是哮喘患者中調控杯狀細胞黏液分泌的主要基因，但近年來一個新的基因－鈣激活氯離子通道基因在哮喘黏液分泌中的作用逐漸被人們認識，進一步的研究還發現其與哮喘的氣道炎癥形成有相關性。抑制該基因調控的鈣激活氯離子通道不僅能控制哮喘的黏液分泌還能抑制血管旁氣道組織炎癥。現在有大量文獻通過描述該基因的表達來反映氣道杯狀細胞的黏液高分泌狀態，該基因與哮喘致病性的相關研究也取得了很大進展，但也有研究從不同角度指出不同觀點。本文簡要介紹鈣激活氯離子通道的結構和特點，及該通道與哮喘黏液分泌和氣道炎癥的相關性和一些最新研究進展。

1 鈣激活氯離子通道的結構和特點

氯離子是體內含量最大的負離子，氯離子通道是指分布于細胞膜和細胞器質膜上的一種跨膜蛋白，一般是由幾個結構域組成的多次跨膜結構，對氯離子和其它陰離子如碘離子(iodide ion，I－)、硝酸根離子(nitrate ion，NO3－)、硫氰酸根離子(thiocyanate ion，SCN－)、氟離子(fluoride ion，F－)有通透性，有時運轉其它陰離子反而更有效。按照氯離子通道開啟關閉的調節因素差異可分為以下幾類:電壓門控氯通道家族、環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophostate，cAMP)/蛋白激酶A激活的氯通道、鈣激活氯通道、容量調節氯通道、配體激活氯通道和細胞內氯通道家族。它參與細胞的電荷和離子傳輸，有調節pH值、細胞容量大小、細胞興奮性和細胞發育凋亡的功能。

鈣激活氯通道(calcium－activated chloride channels，CaCC;或 chloride channels，calcium activated，CLCA)廣泛分布于自然界各種生物中，在人體和小鼠的多種組織中介導鈣離子來激活氯通道，由國際基因命名系統(international system for gene nomencalture，ISGN)命名，是一個近年來發現的新的蛋白家族。目前這一家族在6個哺乳動物中有15個成員［2］，其中bCLCA1和bCLCA2在牛類表達;mCLCA1、mCLCA2、mCLCA3(Gob －5，因與杯狀細胞Goblet cell 相關而命名)、mCLCA4、mCLCA5、mCLCA6在鼠類表達;而人類主要表達 hCLCA1、hCLCA2、hCLCA 3、hCLCA4;此外在豬、馬中也有該基因表達。

鈣激活氯通道在許多生理過程中起重要的作用，如分泌蛋白和鹽的跨上皮轉運、神經元興奮、平滑肌生理特性的維持、卵母細胞受精和心臟動作電位復極化。鈣激活氯通道的通道蛋白孔內對陰離子結合位點較弱，故對除氯離子之外的許多陰離子均有通透性，且特異性識別能力較差，因正常情況下，陰離子以氯離子為主，故稱之為鈣激活氯通道。在不同物種和不同組織中，激活所需要的游離鈣離子濃度也不同，該通道的物理特性呈現時間和電壓特異性，當胞內 Ca2+濃度 ＜1 μmol/L時，該通道為單向通道，而當胞內Ca2+濃度＞1 μmol/L時，則通道完全打開呈現出雙向導通性［3］。Ca2+對通道的調節有可能通過直接結合通道的位點來控制通道開放;或通過鈣調素依賴的蛋白激酶Ⅱ產生的鈣依賴磷酸化途徑。鈣激活氯通道的單通道調節具有多樣性，這預示著存在多個CaCC異構體和其在正常生理情況下起著重要的調節作用。鈣激活氯通道的激活機制包括細胞內鈣庫釋放 Ca2+，胞外 Ca2+內流和Na+/Ca2+交換，結構－功能研究表明離子載體伊屋諾霉素能誘導鈣激活氯通道蛋白表達引起的氯離子電流，目前尚未發現特異性的阻斷劑，但9－AC、尼氟滅酸(niflumic acid，NFA)、DCDPC、DIDS 都能部分阻斷該通道。其中NFA是目前公認的較為常用的阻斷劑［4］，Nakano等［5］證實 NFA 不僅能抑制 IL －13誘導的杯狀細胞增生而且能抑制哮喘的氣道高反應性和嗜酸粒細胞浸潤，IL－13能上調mCLCA3和hCLCA1的表達。

小鼠mCLCA3(Gob－5)和人hCLCA1是異種同源通道蛋白，兩者之間有75%的相似度。mCLCA3是4次跨膜糖蛋白，有3個胞外段，分別為氨基酸胞外段、中間胞外段和羧基胞外段。mCLCA3 cDNA全長2931 bp，開放讀框編碼913個氨基酸殘基。Gob－5主要分布在在胃腸道、呼吸道的黏液顆粒膜，尿道杯狀上皮和其它產生黏液的細胞上，提示它可能與黏液的合成、聚集、分泌相關［6］。

2 調節鈣激活氯通道的機制

調節Gob－5基因的因素尚不完全明確，該基因起作用的方式也不是很清楚，對于其產生作用的假設是基于其氯通道的結構，但是體外研究利用培養細胞系統(NCI－H292、Caco－2)顯示 hCLCA1和Gob－5的過度表達誘導了MUC5AC的轉錄和分泌［7］。

IL－9是決定哮喘易感性的重要Th2細胞因子，過度表達IL－9的小鼠表現出很多人類哮喘的特征。通過抑制消減雜交(supression subtractive hybridization，SSH)技術分析IL－9轉基因小鼠和對照組，發現Gob－5能被IL－9轉基因小鼠特異性地誘導，IL－9和其它Th2細胞因子IL－4、IL－13滴注小鼠同樣能誘導Gob－5的表達，滴注IFN－γ和Th1細胞因子則沒有這個作用。進一步研究顯示這種暴露于抗原誘導的Gob－5表達能被IL－9抗體治療所抑制，提示IL－9在哮喘模型中是誘導Gob－5的重要條件。最后，該研究顯示Th2細胞因子在體外人原代肺細胞中誘導了hCLCA1的表達。這些數據均強烈說明hCLCA1和Gob－5參與了Th2介導的哮喘病理生理過程［8］。另外也有研究認為Gob－5基因的表達由其它Th2細胞因子如IL－13調節的，IL－13促進了杯狀細胞增生和黏液分泌［9］。mCLCA3基因的5'調控區被認為包含1個stat6的轉錄因子的結合位點，這個轉錄因子能介導IL－13的轉導［10］。

組胺在黏液分泌、黏膜水腫和平滑肌收縮中起中心的作用，它是一種強烈刺激杯狀細胞增生的化學物質，有報道稱組胺能調節T細胞介導的免疫反應，IgE介導免疫反應的主要效應細胞－肥大細胞和嗜堿粒細胞通過分泌組胺來調節免疫反應。Yamauchi等［11，12］在 2008 年和 2009 年比較了組胺基因敲除小鼠(HDC－/－C57BL/6)和OVA致敏野生型小鼠(C57BL/6N)，結果顯示組胺基因敲除哮喘老鼠氣道的嗜酸性粒細胞比例明顯低于對照組，但是上皮杯狀細胞比例、Gob－5基因和MUC5AC基因的RNA水平明顯高于野生型哮喘小鼠。這一結果提示組胺可能通過抑制杯狀細胞增生和Gob－5的RNA水平而對氣道急性炎癥起調節作用。2組小鼠的TNF－α、IL－4、IL－5、IL－13和 IFN－γ均比生理鹽水組有所增高，但是組胺敲除小鼠(HDC－/－C57BL/6)中的TNF－α比相同條件下的對照組有明顯增高，提示組胺通過Th2細胞因子起調節作用。Zhao等［13］的研究也證明通過抑制Th2細胞因子治療哮喘的藥物糖皮質激素(地塞米松)能抑制哮喘小鼠BALF中Gob－5的RNA的表達和蛋白分泌。

3 鈣激活氯離子通道與哮喘黏液分泌和氣道炎癥的關系

2001年Nakanish等［7］首先利用SSH技術在過敏性哮喘小鼠模型的肺中確定了1個特異性引起氣道高反應性基因－Gob－5。之前Komiya等［14］報道Gob－5基因在小腸、結腸、胃和尿道中大量表達，在氣道組織中只有少量表達，Nakanish等［7］則證實了Gob－5在氣道高反應性模型小鼠中大量表達，并且Gob－5的表達產物主要分布在分泌黏液的杯狀細胞中。在氣道高反應性小鼠模型的氣道內滴注Gob－5反義RNA顯著抑制了氣道高反應性和黏液分泌等哮喘表現，反之利用腺病毒載體在上皮中過度表達Gob－5基因則惡化了哮喘的上述表現。Nakanish等［7］進一步利用 hCLCA1導入人黏液上皮系細胞NCI－H292后，誘導了黏液產生和MUC5AC的表達。MUC基因的上調與杯狀細胞的增生有關，被認為是氣道杯狀細胞增生的標志，MUC基因編碼了各種黏液的糖蛋白，它包括1組基因(例如MUC1，MUC2和MUC4)，MUC5AC、MUC2和MUC5B是主要在氣道內表達的基因，在哮喘患者和哮喘動物模型的組織中，MUC5AC的水平均有顯著的增高。Gob－5在人類黏液表皮樣細胞NCI－H292中能誘導MUC5表達的增加，被認為是黏液細胞化生和過度增生的第1步。氣道上皮Gob－5的過度表達加重了哮喘小鼠模型的氣道高反應性，并促使杯狀細胞增生，黏液過度產生和嗜酸粒細胞浸潤。

小鼠中的Gob－5基因對應人類中的hCACL1基因，研究報道hCACL1基因的過度表達惡化了哮喘。hCLCA1在疾病中的病理生理依據主要來源于2個方面:首先，臨床研究提示COPD、哮喘和肺囊性纖維化病人體內的hCLCA1表達增高［15］，其次基因分析顯示hCLCA1和4種哮喘的表現相關(支氣管反應性、皮膚劃痕實驗、總IgE、嗜酸粒細胞計數)，進一步的hCLCA基因SNP分析顯示其與COPD、成人和兒童哮喘有相關性［16］。

2005年Long等［17］用OVA致敏 Gob－5基因敲除小鼠發現BALF的炎癥比對照組小鼠明顯增強，構成BALF炎癥的主要細胞是中性粒細胞，Gob－5基因敲除小鼠的血管旁組織炎癥、杯狀細胞增生、黏液過度分泌則明顯下降，乙酰甲膽堿激發后，Gob－5基因敲除小鼠的氣道高反應性顯著好于對照組。氣道內注入LPS后，Gob－5基因敲除小鼠與對照組小鼠相比，BALF中性粒細胞炎癥增強而血管旁組織炎癥減少，對黏液分泌和杯狀細胞增生則幾乎沒有什么作用，這證實了過敏性免疫反應中Gob－5與杯狀細胞增生和黏液分泌的關系，同時提示Gob－5在啟動免疫反應中與組織炎癥相關。

但是Robichaud等［18］在2005年利用 Gob－5基因敲除小鼠建立的過敏性哮喘小鼠模型進行研究發現，用OVA和IL－13致敏的Gob－5基因敲除小鼠和對照小鼠在杯狀細胞增生和氣道炎癥方面沒有區別，體外實驗用siRNA敲除CLCA－1的人肺上皮細胞也不能減少黏液表達，提示Gob－5的表達并非過敏性哮喘小鼠和體外細胞黏液分泌的必要條件。同時 Robichaud 等［18］研究了mCLCA1、mCLCA2 和mCLCA4，發現這些基因并不能代償mCLCA3所起的作用。這和之前報道的結果［7，17］產生了矛盾，分析可能的原因是Gob－5并不直接分泌黏液，而是作為1個黏液分泌的啟動因素起作用，當Gob－5基因被敲除后，機體有可能通過其它鈣激活氯通道基因或者其它機制進行代償，從而導致兩者之間不產生差異，代償機制的一個可能是2組之間有3倍差異的精氨酸酶，有文獻［19－21］報道它可能會導致肺黏液分泌增加;另一個可能的原因是研究所用的小鼠基因背景不同，Robichaud等［18］使用小鼠品系為 C57/BL6，而既往研究的小鼠為 BALB/c;當時未檢測mCLCA5也是一個重要的原因。該文顯示雖然RNAi敲除hCLCA1基因表達不能改變MUC5AC的RNA產物，但是對照組 hCLCA1過度表達卻使得MUC5AC大量增生，一種可能的解釋是hCLCA1是黏液分泌的一種共啟動因素或者信號通路，一旦黏液信號瀑布被激發，則反饋性地抑制hCLCA1的活動。

Mundhenk等［2］通過mCLCA3轉染人類胚胎腎臟293細胞證明110 kD的mCLCA3前體產生75 kD的氨基端和35 kD的羧基端蛋白質，并以可溶性糖蛋白的囊泡形式分泌出胞而不是在細胞膜上出現。這個結果提示2種mCLCA3的分裂產物可能沒有形成陰離子通道，而是作為細胞外的信號分子而起作用，這也證明了Robichaud等［18］的假設。另外Gibson等［22］也認為hCLCA1和mCLCA3是作為細胞間的信號分子而不是作為離子通道起作用。

Petel等［10］使用2種品系的小鼠雜交，其中C57BL/6J近交系小鼠產生黏液過度分泌和氣道高反應性，BALB/cJ小鼠則近期產生相同的反應，長期則沒有這種作用，分析F2代中只出現上述一種表現的小鼠發現mCLCA3能誘導黏液細胞化生而對氣道高反應性沒有作用。進一步研究利用生物信息分析鈣激活氯通道的基因座時發現mCLCA5在mCLCA3－/－小鼠中也能促使氣道杯狀細胞化生，mCLCA5在mCLCA3缺失的情況下起到了代償作用。

總之，鈣激活氯通道家族作為一種重要的蛋白，與哮喘杯狀細胞增生和黏液過度分泌狀態明確相關，起著起始和調控黏液分泌和氣道炎癥的作用，它能通過上調MUC5AC的基因而促使杯狀細胞增生和黏液過度分泌，調節該家族的方式是通過Th2細胞分泌的細胞因子起作用。進一步研究鈣激活氯通道的結構和功能，能為治療干預哮喘高黏液分泌狀態提供新的靶點。

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